Quantificação de Densidades Celulares e Propriedades Antigênicas usando Levitação Magnética

Summary

Este artigo descreve um método baseado em levitação magnética que pode detectar especificamente a presença de antígenos, solúveis ou ligados à membrana, quantificando mudanças na altura de levitação das contas de captura com densidades fixas.

Abstract

O método descrito foi desenvolvido com base nos princípios da levitação magnética, que separa células e partículas com base em sua densidade e propriedades magnéticas. Densidade é um tipo de célula que identifica propriedade, diretamente relacionada à sua taxa metabólica, diferenciação e status de ativação. A levitação magnética permite uma abordagem de um passo para separar, imagem e caracterizar com sucesso as células sanguíneas circulantes, e detectar anemia, doença falciforme e células tumorais circulantes com base na densidade e propriedades magnéticas. Esta abordagem também é favorável à detecção de antígenos solúveis presentes em uma solução usando conjuntos de contas de baixa e alta densidade revestidas com anticorpos de captura e detecção, respectivamente. Se o antígeno estiver presente na solução, ele fará a ponte entre os dois conjuntos de contas, gerando um novo complexo de contas de contas, que levitará entre as fileiras de contas revestidas de anticorpos. O aumento da concentração do antígeno alvo na solução gerará um número maior de complexos de contas de contas quando comparados com menores concentrações de antígeno, permitindo assim medições quantitativas do antígeno alvo. A levitação magnética é vantajosa para outros métodos devido ao seu tempo de preparação amostral reduzido e à falta de dependência dos métodos clássicos de leitura. A imagem gerada é facilmente capturada e analisada usando um microscópio padrão ou dispositivo móvel, como um smartphone ou um tablet.

Introduction

Levitação magnética é uma técnica desenvolvida para separar, analisar e identificar os tipos celulares^1,2,3, proteínas^4,5 e opioides 6 baseadas^apenas em sua densidade específica e propriedades paramagnéticas. A densidade celular é uma propriedade única e intrínseca de cada tipo celular diretamente relacionada à sua taxa metabólica e ao estado de diferenciação^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Quantificar mudanças sutis e transitórias na densidade celular durante condições de estado constante, e durante uma variedade de processos celulares, poderia permitir uma visão incomparável da fisiologia celular e da fisiopatologia. Alterações na densidade celular estão associadas à diferenciação celular^15,16, progressão do ciclo celular^9,17,18,19, apoptose^20,21,22,23, e transformação maligna^24,25,26 . Portanto, a quantificação de alterações específicas na densidade celular, pode ser usada para diferenciar entre células de diferentes tipos, bem como discriminar entre o mesmo tipo de células submetidas a vários processos de ativação. Isso permite experimentos que visam uma determinada subsumão celular, onde mudanças dinâmicas na densidade servem como um indicador do metabolismo celular alterado²⁷. Como foi estabelecido que uma célula pode alterar sua densidade em resposta a um ambiente em mudança^7,é imperativo medir a cinética da célula em relação à sua densidade para entendê-la plenamente, que os métodos atuais podem não fornecer¹². A levitação magnética, por outro lado, permite uma avaliação dinâmica das células e suas propriedades²⁸.

As células são diamagnéticas, o que significa que elas não têm um momento de dipolo magnético permanente. No entanto, quando exposto a um campo magnético externo, um momento fraco de dipolo magnético é gerado nas células, na direção oposta do campo aplicado. Assim, se as células forem suspensas em uma solução paramagnética e expostas a um forte campo magnético vertical, elas levitarão para longe da fonte magnética e pararão até uma altura, que depende principalmente de sua densidade individual. A levitação diamagnética de um objeto confinado ao mínimo de um campo magnético inhomogenous é possível quando os dois seguintes critérios são cumpridos: 1) a suscetibilidade magnética da partícula deve ser menor do que a do meio circundante, e 2) a força magnética deve ser forte o suficiente para contrabalançar a força de flutuação da partícula. Ambos os critérios podem ser preenchidos suspendendo os RBCs em um buffer magnético e criando fortes gradientes de campo magnético com ímãs permanentes pequenos, baratos e comercialmente disponíveis¹. A posição de equilíbrio de uma partícula presa magneticamente em um eixo ao longo da direção da gravidade é determinada por sua densidade (em relação à densidade do tampão), sua suscetibilidade magnética (em relação à suscetibilidade magnética do tampão) e a assinatura do campo magnético aplicado. Como a densidade e as propriedades magnéticas da solução são constantes em todo o sistema, as propriedades de densidade intrínseca das células serão o principal fator determinante da altura de levitação das células, com células mais densas levitando mais baixas em comparação com células menos densas. Esta abordagem utiliza um conjunto de duas contas de referência de densidade (1,05 e 1,2 g/mL) que nos permite usar análises precisas e racionmétricas para medições de densidade. Alterar a concentração da solução magnética permite isolar diferentes populações celulares, como RBCs de WBCs, já que a densidade das células circulantes é específica das células, removendo a necessidade de protocolos de isolamento ou outras manipulações celulares.

A maioria dos métodos de detecção usados em pesquisas de biologia dependem da extrapolação de eventos de ligação específicos em sinais lineares fáceis de quantificar. Esses métodos de leitura são muitas vezes complexos e envolvem equipamentos especializados e pessoal científico dedicado. Uma abordagem destinada à detecção de antígenos encontrados na membrana plasmática das células ou vesículas extracelulares ou que são solúveis no plasma, usando uma ou duas contas revestidas de anticorpos, está aqui descrita. As contas devem ser de densidades diferentes umas das outras e das dos alvos interrogados. A presença do antígeno alvo em qualquer biofluido é traduzida em uma mudança específica e mensurável na altura de levitação de uma célula antígeno positivo que está ligada a uma conta de detecção. No caso de antígenos solúveis ou vesículas extracelulares, eles são obrigados tanto à captura quanto à detecção de contas, formando um complexo de contas de contas em vez de complexo de células de contas. A mudança na altura da levitação depende da nova densidade dos complexos de células de contas ou contas de contas. Além da mudança na altura de levitação dos complexos, o que indica a presença de antígeno no biofluido, o número de complexos também depende da quantidade de destino, tornando a levitação magnética também uma abordagem quantitativa para detecção de antígenos²⁴.

Protocol

O protocolo experimental utilizado neste estudo foi aprovado pelo Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Configuração do instrumento NOTA: As células levitando de imagem requer dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z para serem colocados com o mesmo polo voltados um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético …

Representative Results

A levitação magnética concentra objetos de diferentes densidades em diferentes alturas de levitação, dependendo da densidade do objeto, sua assinatura magnética, a concentração de solução paramagnética e a força do campo magnético criado por dois ímãs fortes e de terras raras. À medida que os dois ímãs são colocados em cima um do outro, as amostras levitando só podem ser vistas, mantendo a iluminação de Köhler, usando um microscópio virado de lado(Figura 1). A altura …

Discussion

Centrifugação gradiente é atualmente a técnica padrão para isolar componentes subcelulares com base em suas densidades únicas. Essa abordagem, no entanto, requer o uso de meios de gradientes especializados, bem como equipamentos de centrífuga. A abordagem de levitação magnética aqui apresentada permite uma investigação detalhada das propriedades morfológicas e funcionais das células circulantes, com mínimo, se alguma manipulação das células, proporcionando um acesso quase in vivo às células c…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube