Бисерная нагрузка вводит белки, плазмиды и частицы в адгезивные клетки млекопитающих. Этот метод клеточной загрузки является недорогим, быстрым и существенно не влияет на здоровье клеток. Он лучше всего подходит для визуализации живых клеток.
Многие эксперименты по визуализации живых клеток используют экзогенные частицы (например, пептиды, антитела, шарики) для маркировки или функционирования в клетках. Однако введение белков в клетку через ее мембрану затруднено. Ограниченный выбор современных методов борется с низкой эффективностью, требует дорогостоящего и технически сложного оборудования или функционирует в узких параметрах. Здесь мы описываем относительно простую и экономически эффективную технику загрузки ДНК, РНК и белков в живые клетки человека. Нагрузка на шарики вызывает временное механическое разрушение клеточной мембраны, позволяя макромолекулям проникать в адгезивные, живые клетки млекопитающих. При цене менее 0,01 доллара США за эксперимент загрузка шариков является наименее дорогим доступным методом загрузки ячеек. Кроме того, нагрузка на шарики существенно не напрягает клетки и не влияет на их жизнеспособность или пролиферацию. В этой рукописи описываются этапы процедуры загрузки бусин, адаптации, вариации и технические ограничения. Эта методология особенно подходит для визуализации живых клеток, но обеспечивает практическое решение для других применений, требующих введения белков, бусин, РНК или плазмид в живые, адгезивные клетки млекопитающих.
Загрузка макромолекул в клетки млекопитающих требует методологии, которая позволяет им пересекать плазматическую мембрану клетки1. Несколько способов могут вводить плазмиды в клетки млекопитающих посредством трансфекции, включая липосомальную трансфекцию2 и диэтиламиноэтил-декстрановую трансфекцию3. Однако способы загрузки белков или мембранно-непроницаемых частиц в клетки более ограничены.
Несколько методов обошли это трудное препятствие, используя различные стратегии. Во-первых, микроинъекция доставляет частицы через микропипетку в живые клетки под микроскопом4. Хотя, возможно, это самый контролируемый и наименее инвазивный метод, этот метод имеет относительно низкую пропускную способность, потому что клетки должны быть загружены одна за одной. Кроме того, микроинъекция требует специализированного оборудования и является технически сложной.
Во-вторых, электропорация — это способ электроинъендуции белков в клетки посредством вызванного напряжением мембранного разрушения5,6,7. Однако этот метод опять же требует специализированного, дорогостоящего оборудования, а шок может вызвать клеточный стресс и смертность. Кроме того, клетки должны быть трипсинизированы перед электропорацией и впоследствии повторно покрыты, ограничивая временные рамки, в которые клетки могут быть исследованы после электропорации.
В-третьих, клеточные мембраны могут быть химически модифицированы для временной, обратимой пермеабилизации8,9. Загрузка стрептолизин-О вводит эндотоксин в клеточные мембраны, который образует временные поры, позволяя экзогенным мембранно-непроницаемым частицам, включая белки и плазмиды ДНК, проникать в клетки10. После 2-х ч восстановления около половины клеток восстанавливают эти поры и останавливают интернализацию частиц из раствора. Однако этот метод требует длительного времени восстановления и несовместим с типами клеток, которые не переносят эндотоксины.
В-четвертых, механическое разрушение нагружает частицы в клетки посредством физического возмущения клеточной мембраны11. Это может быть сделано несколькими способами, включая царапины, соскобливание и прокатку бусин поверх ячеек12,13. Еще в 1987 году шарики использовались для механической загрузки белков в клетки14. Совсем недавно метод загрузки шариков был оптимизирован и адаптирован за пределами белков, чтобы включить нагрузку плазмид и РНК, как описано здесь.
Загрузка бусин — это простой, недорогой и быстрый метод загрузки белка и плазмид в адгезивные клетки человека. Стеклянные шарики ненадолго закатывают поверх клеток, временно нарушая их клеточную мембрану. Это позволяет частицам в растворе проникать. Поскольку нагрузка на шарики имеет низкую эффективность, она лучше всего подходит для экспериментов с одномолекулярной или одноклеточной микроскопией. Нагрузка на шарики может вводить широкий спектр белков, включая фрагментированные антитела (Fab),15,16 очищенных белков, таких как scFvs,17 внутрител,18,19или белки оболочки мРНК, например, белок оболочки MS2 (MCP)20,21. Векторы экспрессии плазмид также могут быть добавлены к белковым раствору и нагружены бусинами одновременно22,23,24,25.
Помимо белков и плазмид, молекулы размером до 250 нм полистирольных шариков были введены в клетки посредством загрузки шариков (личное общение). Загрузка бусин невероятно недорогая, стоит менее 0,01 доллара США за эксперимент в материалах и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования. Стоимость еще больше снижается за счет минимизации количества зондов, используемых в эксперименте, поскольку загружаются только ячейки в центральной микроявли диаметром 14 мм камеры визуализации. Следует отметить, что ограниченная площадь загрузки означает, что загрузка шариков не идеальна для загрузки навалочных ячеек.
В этой рукописи представлен процесс загрузки бусин, в том числе то, как построить аппарат для загрузки бусин и провести эксперимент. Он показывает, что белки, РНК и ДНК могут быть загружены в различные типы клеток и что два разных, одновременно загруженных шариками белка имеют высококоррелированные клеточные концентрации и относительно низкую дисперсию. Также обсуждаются вариации в протоколе, основанные на типе клетки и загрузке белка, плазмиды или РНК. Хотя считается, что бусины перфорируют и разрушают клеточную мембрану, при надлежащем выполнении процесс загрузки шариков вытесняет только небольшое количество клеток из нижней части камеры визуализации. После короткого восстановительного периода клетки продолжают расти и делиться. Эта методология идеально подходит для экспериментов по микроскопии живых клеток, включая отслеживание одномолекулярных белков и РНК, обнаружение постпереводной модификации, наблюдение динамических клеточных механизмов или мониторинг субклеточной локализации15,16,22,26,27.
Описанная здесь техника загрузки шариков является экономически эффективным и эффективным по времени методом введения макромолекул и других частиц в адгезивные ячейки. Этот универсальный процесс может загружать белок(Рисунок 2А)15,16,26,27,комбинацию белка и плазмид(Рисунок 2B,C)22,25,РНК(Рисунок 4C),100 и 250 нм полистирольных шариков (личное соответствие), синтетические красители39 или квантовыеточки 34,40 . Нагрузка на шарики может иметь возможность загружать и другие типы мембранопроницаемых частиц. Его наиболее часто используемое применение заключается в загрузке антител или Fabs для нацеливания на эндогенные эпитопы, такие как постпереходные модификации (PTM), в живые клетки. Мишени, такие как PTM, часто трудно маркировать в живых клетках без установленных PTM-специфических, генетически закодированных зондов41,42. Напротив, загрузка шариков может вводить несколько типов зондов, репортеров или других молекулярных инструментов вместе в одну ячейку для мониторинга нескольких считывания одновременно. Мы ожидаем, что загрузка шариков будет полезным методом для загрузки различных макромолекул или частиц.
Основным преимуществом загрузки бисером является низкая стоимость: каждый эксперимент стоит менее 0,01 USD. Аппарат-погрузчик для бисера может быть легко изготовлен с использованием недорогих материалов общей стоимостью ~ 150 долларов США, что значительно дешевле, чем любой другой метод загрузки ячеек. Стоимость аппарата погрузчика для бисера может быть дополнительно снижена до менее чем 10 долларов США путем замены многоразовой металлической камеры на пластиковую. Для этого либо просверлите отверстие в камере 35 мм, либо извлеките стекло из камеры со стеклянным дном 35 мм, затем надежно закрепите сетку на месте скотчем. Вместо устройства загрузка бусин может быть выполнена даже с использованием широкопроходимого наконечника пипетки объемом 1000 мкл для зачерпывания и посыпания бусин на ячейки, хотя это изменение затрудняет посыпку монослоя бусин на ячейки (этап 4.6).
Еще одно преимущество бусиновой нагрузки заключается в том, что клетки могут сохранять нормальную общую морфологию, быстро восстанавливаться и продолжать расти и делиться, по крайней мере, для клеток U2OS, RPE1 и HeLa, изученных здесь, и для других клеточных линий, изученных в других местах(рисунок 3; Рисунок 4А,В; Дополнительное видео 1; и таблица 1)31. Во время загрузки бусин клетки подвергаются физическому стрессу, а иногда смещаются и отслаиваются (~ 5% клеток шелушения при оптимальных условиях, но большая потеря клеток может произойти, если нагрузка на бусин выполняется слишком сильно или слишком много стеклянных шариков загружается поверх ячеек, как показано на рисунке 3B). Тем не менее, ячейки, нагруженные бисером, которые остаются прикрепленными к крышке, обычно выглядят здоровыми и могут быть изображены уже через 30 минут после загрузки бусин(рисунок 3A). Как правило, мы допускаем 30-минутный период восстановления клеток, но ожидаем, что визуализация возможна раньше после загрузки шариков.
Основным недостатком этого метода является то, что клетки должны быть способны выдерживать незначительные физические нагрузки во время нагрузки и надежно прилипать к крышке. Плохо адгезивные клеточные линии или клетки, выращенные на пластинах с покрытием (например, HEK и стволовые клетки), часто отсоединяются при мягком постукивании во время загрузки шарика. Кроме того, опыт показал, что первичные нейроны слишком чувствительны к загрузке бусин.
Загрузка шариков лучше всего подходит для одноклеточных или одномолекулярных экспериментов. По нашему опыту, нагрузка на шарики имеет примерно 20-40% эффективности загрузки белка, и ~ 20% клеток, нагруженных бисером, также экспрессируют совместно загруженную плазмиду(Рисунок 2A,B). Таким образом, плазмиды, нагрузляемые шариками, могут быть менее эффективными для экспрессии белка, чем очищенные белки, загружающие шарики, потому что плазмиды должны не только проникать в клетки, но и экспрессиваться (что включает, среди прочего, ядерный импорт, транскрипцию и трансляцию, каждый из которых может снизить эффективность экспрессии). Низкая эффективность экспрессии плазмид с бисероплетением может быть обойдена с помощью альтернативных протоколов трансфекции, таких как липофекция, перед загрузкой бисера белков или зондов16,27. Кроме того, инкубирование клеток в оптимальной среде в течение 30 мин до загрузки шарика может способствовать экспрессии плазмиды. Из-за низкой экспрессии плазмидная нагрузка на шарики не часто использовалась в качестве альтернативы трансфекции на основе липофекции в этой лаборатории. Единственное исключение — когда очищенный белок, такой как Fab, должен быть совместно загружен, и в этом случае довольно удобно загружать белок и плазмиду одновременно. Более того, для клеток, которые не реагируют или не переносимы на липофекцию, нагрузка на шарики может обеспечить альтернативный, хотя и малоэффективный, метод экспрессии переходных плазмид.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны сотрудникам лаборатории Стасевича за бесчисленные беседы, которые помогли усовершенствовать и развить этот протокол. В частности, д-р Линда Фореро и д-р Фил Фокс за советом по загрузке бисером различных типов клеток. Мы хотели бы искренне поблагодарить д-ра Йоко Хаяси-Таканаку, д-ра Юко Сато и д-ра Хироси Кимуру за то, что они поделились своим протоколом загрузки стеклянных бусин. Мы очень благодарны доктору Ашоку Прасаду и доктору Диего Крапфу за то, что они щедро поделились своими протоколами загрузки бусин для введения неорганических частиц в клетки. Мы благодарны доктору Трэвису Сандерсу, Крейгу Маршаллу и доктору Томасу Сантанджело за то, что они щедро поделились своим меченым РНК-реагентом. ALK, MNS, CAC, GG и TJS были поддержаны грантом Национального института здравоохранения (NIH) R35GM119728 и грантом КАРЬЕРЫ Национального научного фонда (NSF) MCB-1845761, оба для TJS. CAC также был поддержан наградой NSF NRT DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |