الفينوتينوبينج المناعي وفرز الخلايا من MKs الإنسان من المصادر الأولية البشرية أو المتمايزة في المختبر من السلف الهيماتوبويات
Summary
هنا، نقدم استراتيجية مناعة لتوصيف تمايز الخلايا العملاقة، ونظهر كيف تسمح تلك الاستراتيجية بفرز الخلايا الضخمة في مراحل مختلفة مع مفرز خلايا مضان. يمكن تطبيق المنهجية على الأنسجة الأولية البشرية ، ولكن أيضا على الخلايا الضخمة المتولدة في الثقافة في المختبر.
Abstract
التمايز Megakaryocyte (MK) يشمل عددا من الدورات البطينية التي تؤدي إلى متعدد الأضلاع للغاية (تصل حتى >64N) وخلية كبيرة للغاية (40-60 ميكرومتر). على عكس المعرفة المتزايدة بسرعة في megakaryopoiesis على بيولوجيا الخلية والمستوى الجزيئي ، يقتصر توصيف megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي على تحديد MKs الناضجة باستخدام علامات سطحية خاصة بالنسب ، في حين أن مراحل التمايز السابقة MK لا تزال غير مستكشفة. هنا، نقدم استراتيجية مناعة تسمح بتحديد مراحل التمايز MK المتعاقبة، مع زيادة حالة الحيلة، في المصادر الأولية البشرية أو في الثقافات المختبرية مع لوحة دمج MK علامات سطح محددة وغير محددة. على الرغم من حجمها وهشاشتها، يمكن أن تكون MKs مناعية باستخدام اللوحة المذكورة أعلاه ومثرية بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس في ظل ظروف محددة من الضغط وقطر الفوهة. يسهل هذا النهج الدراسات متعددة الوميك ، بهدف فهم أفضل لتعقيد megakaryopoiesis وإنتاج الصفائح الدموية في البشر. قد يشكل التوصيف الأفضل للأورام الضخمة أمرا أساسيا في تشخيص أو تشخيص الأمراض المرتبطة بالنسب والخبيثة.
Introduction
تتطور الخلايا الضخمة (MKs) من الخلايا الجذعية الدموية (HSCs) بعد عملية معقدة تسمى megakaryopoiesis ، والتي يتم تنظيمها بشكل رئيسي من خلال هرمون thrombopoietin (TPO). تصف الرؤية الكلاسيكية ل megakaryopoiesis الرحلة الخلوية من HSCs من خلال سلسلة من المراحل الهرمية للأسلاف الملتزمين والخلايا السليفة ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى عضو الكنيست الناضج. أثناء النضج ، تواجه MKs جولات متعددة من بطانة الرحم ، وتطوير نظام غشاء ترسيم معقد داخل الخلايا (DMS) ، والذي يوفر مساحة غشاء كافية لإنتاج الصفائح الدموية ، وإنتاج وتعبئة عدد كبير من العوامل الموجودة في الحبيبات المختلفة الموروثة من الصفائح الدموية الناضجة1و2و3. ونتيجة لذلك، فإن MKs الناضجة هي خلايا كبيرة (40-60 ميكرومتر) تتميز ب نواة متعددة الأضلاع للغاية (تصل حتى إلى >64N). تشير الدراسات الحديثة إلى طرق بديلة تفرق بها HSCs إلى MKs متجاوزة نقاط التفتيش التقليدية للالتزام بالنسب استجابة لبعض الحالات المرضية الفيزيائية4و5و6و7و8و9و 10و11. وتسلط هذه النتائج الضوء على أن التمايز الدموي تجاه عضو الكنيست الناضج هو عملية متصلة ومتكيفة تستجيب للاحتياجات البيولوجية.
مع زيادة المعرفة حول بيولوجيا الخلية والجوانب الجزيئية التي تميز megakaryopoiesis12، فإن معظم الأبحاث المخصصة لدراسة العملية عن طريق قياس التدفق الخلوي تقتصر على تحديد MKs الناضجة باستخدام علامات سطحية خاصة بالنسب(أي CD42A /B ، CD41/CD61) ، في حين أن مراحل التمايز السابقة MK لا تزال غير مستكشفة. ونحن وثقت سابقا استراتيجية لمرحلة megakaryopoiesis في نخاع العظام الماوس والعظام المستمدة من نخاع MK الثقافات13،14، والتي قمنا بتكييفها وتطبيقها على البشر15. في هذه المقالة نعرض استراتيجية مناعة تسمح بتحديد خصائص megakaryopoiesis ، من HSCs إلى MKs الناضجة ، في المصادر الأولية البشرية (نخاع العظام – BM – والدم المحيطي – PB – ) أو في الثقافات المختبرية باستخدام لوحة دمج علامات سطح محددة وغير محددة MK (CD61 ، CD42B ، CD49B ، CD31 ، KIT و CD71 ، من بين أمور أخرى). على الرغم من حجمها الكبير وهشاشتها ، يمكن أن تكون MKs مناعية باستخدام علامات سطح الخلية المذكورة أعلاه ومثرية بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس في ظل ظروف محددة من الضغط وقطر الفوهة لتقليل تمزق الخلايا و / أو الضرر. هذه التقنية تسهل النهج متعددة Omics، بهدف فهم أفضل لتعقيد megakaryopoiesis وإنتاج الصفائح الدموية في صحة الإنسان والمرض. والجدير بالذكر، أنها سوف تشكل أداة مفيدة للمساعدة في التشخيص والتكهن في سياق سريري من الطلب المتزايد.
في هذه المخطوطة نوثق استراتيجية لتنظيم الهياكل الضخمة البشرية مع لوحة دمج علامات سطح MK محددة وغير محددة من المصادر الأولية أو ولدت في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم بروتوكول لفرز، مع مضان تنشيط خلية الفرز، والكسور المفضلة و MKs ناضجة(الشكل 1). هذه الخطوة ليست شعبية، كما أنها صعبة من الناحية الفنية نظرا لحجم وهشاشة كبيرة من MKs. ومع ذلك، فقد تم استخدامه في كل من الماوس وعينات نخاع العظم البشري سابقا، ونظرا للتقدم التكنولوجي، مع نتيجة أفضل في كل مرة16،17،18. المصادر الأساسية البشرية حيث يمكن دراسة MKs أو MK السلائف تشمل نخاع العظام ودم الحبل السري والدم المحيطي، من بين أمور أخرى. معالجة عينة المناسبة لعزل كسر الخلية ذات الصلة للتحليل على كل عينة من الأهمية. يتم دمج الإجراءات القياسية ، مع بعض الاعتبارات التي يجب مراعاتها عند استهداف دراسة megakaryopoiesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
معظم البحوث التي تركز على دراسة megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي يقتصر حتى الآن على تحديد مجموعات فرعية MK باستخدام علامات سطح النسب فقط محددة(أي، CD42A/CD42B ، CD41/CD61) ، في حين تم فحص مراحل التمايز MK في وقت سابق بشكل سيئ. في هذه المقالة نعرض استراتيجية مناعة لمعالجة توصيف التدفق الشامل لقي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ماركوس بيريز باستريشيا ولورينا رودريغيز لورينزو وبغونا غارسيا منديز وبالوما سيريزو وألمودينا باييرو وماريا دي لا بوفيدا – كولومو على الدعم التقني. وقد دعم هذا العمل جزئيا من المنح الطبية (Roche SP200221001) إلى A.B، وهي زمالة RYC (RYC-2013-12587؛ الوزير دي إيكونوميا إي سيفيبيتفيداد، إسبانيا) ومنحة I+D 2017 (SAF2017-85489-P؛ الوزير دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس، إسبانيا وفودوس فيدر) إلى L.G. ، منحة سيفيرو أوتشوا (PA-20-PF-BP19-014؛ كونسيجيريا دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس ديل برينسيبيادو دي أستورياس، إسبانيا) إلى بي.M-ب. ومنحة ما بعد الدكتوراه داخل المنظمة لعام 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spain) إلى A.A.-H. نشكر رينييه فان دير ليندن لتقاسم معرفته (والوقت)، وخاصة نصيحته الحكيمة على متعدد الألوان الموسومة الأجسام المضادة لوحة مزيج ومتعددة اللون حبة التحكم إعداد.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Referências
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
