यहां, हम मेगाकारेयोसाइट भेदभाव के लक्षण वर्णन के लिए एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, और दिखाते हैं कि कैसे यह रणनीति फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टर के साथ विभिन्न चरणों में मेगाकारियोसाइट्स की छंटाई की अनुमति देती है। पद्धति मानव प्राथमिक ऊतकों पर लागू की जा सकती है, लेकिन विट्रो मेंसंस्कृति में उत्पन्न मेगाकारियोसाइट्स के लिए भी।
मेगाकारियोसाइट (एमके) भेदभाव में कई एंडोमाइटिक चक्र शामिल हैं जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक पॉलीप्लाइड (यहां तक कि >64N तक पहुंचना) और बेहद बड़ी कोशिका (40-60 माइक्रोन) होती है। सेल जीव विज्ञान और आणविक स्तर पर मेगाकैरियोपोइसिस में तेजी से बढ़ते ज्ञान के विपरीत, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मेगाकार्योपोइसिस का लक्षण वर्णन वंश-विशिष्ट सतह मार्कर का उपयोग करके परिपक्व एमकेएस की पहचान तक सीमित है, जबकि पहले एमके भेदभाव चरण बेरोज़गार रहते हैं। यहां, हम एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति पेश करते हैं जो लगातार एमके भेदभाव चरणों की पहचान की अनुमति देता है, बढ़ती प्लॉयडी स्थिति के साथ, मानव प्राथमिक स्रोतों में या विट्रो संस्कृतियों में एमके विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर को एकीकृत करने वाले पैनल के साथ। इसके आकार और कमजोरी के बावजूद, एमके को उपरोक्त पैनल का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइप किया जा सकता है और दबाव और नोजल व्यास की विशिष्ट परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई द्वारा समृद्ध किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण मनुष्यों में मेगाकारियोपोइसिस और प्लेटलेट उत्पादन की जटिलता को बेहतर ढंग से समझने के उद्देश्य से मल्टी-ओमिक्स अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। मेगाकार्योपोइसिस का बेहतर लक्षण वर्णन वंश से संबंधित विकृतियों और द्रोह के निदान या पूर्वानुमान में मौलिक हो सकता है।
मेगाकारियोपिटसिट्स (एमकेएस) मेगाकारियोपोइसिस नामक एक जटिल प्रक्रिया के बाद हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) से विकसित होता है, जिसे मुख्य रूप से हार्मोन थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) द्वारा करवाया जाता है। मेगाकार्योपोइसिस का शास्त्रीय दृष्टिकोण एचएससी से सेलुलर यात्रा का वर्णन प्रतिबद्ध जनक और अग्रदूत कोशिकाओं के पदानुक्रमित चरणों के उत्तराधिकार के माध्यम से करता है, जो अंततः एक परिपक्व एमके के लिए अग्रणी होता है। परिपक्वता के दौरान, एमके्स एंडोमाइटोसिस के कई दौरों का अनुभव करते हैं, एक जटिल इंट्रासेलुलर सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) विकसित करते हैं, जो प्लेटलेट उत्पादन के लिए पर्याप्त झिल्ली सतह प्रदान करता है, और परिपक्व प्लेटलेट्स1,2,3द्वारा विरासत में मिली विभिन्न कणिकाओं में निहित कारकों की अधिकता का कुशलतापूर्वक उत्पादन और पैक करता है। नतीजतन, परिपक्व एमके बड़ी कोशिकाएं (40-60 माइक्रोन) हैं जो अत्यधिक पॉलीप्लाइड नाभिक (यहां तक कि >64N तक पहुंचने) की विशेषता हैं। हाल के अध्ययनों से उन वैकल्पिक मार्गों का सुझाव मिलता है जिनके द्वारा एचएससी कुछ फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों 4 , 5,6,7,8,9,10,11के जवाब में पारंपरिक वंश प्रतिबद्धता चौकियों को दरकिनार करतेहुएएमकेएस में अंतर करते हैं । इन निष्कर्षों पर प्रकाश डाला है कि परिपक्व एमके के प्रति हेमेटोपोइटिक भेदभाव एक सातत्य और अनुकूली प्रक्रिया है जो जैविक जरूरतों का जवाब देती है।
सेल जीव विज्ञान और मेगाकैरियोपॉजिस12की विशेषता वाले आणविक पहलुओं पर बढ़ते ज्ञान के साथ, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रक्रिया के अध्ययन के लिए समर्पित अधिकांश शोध वंश-विशिष्ट सतह मार्कर(यानी, सीडी 42ए/बी, सीडी 41/सीडी 61) का उपयोग करके परिपक्व एमके की पहचान तक सीमित हैं, जबकि पहले एमके विभेद चरण अनएक्सप्लोरे गए रहते हैं। हमने पहले माउस बोन मैरो और बोन मैरो-व्युत्पन्न एमके संस्कृतियों13, 14में मेगाकार्योपोइस को मंचित करने की रणनीति का दस्तावेजीकरण किया था, जिसे हमने मनुष्यों के लिए अनुकूलित और लागू किया है15। वर्तमान लेख में हम एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति दिखाते हैं जो मानव प्राथमिक स्रोतों (बोन मैरो-बीएम-एंड पेरिफेरल ब्लड-पीबी-) या विट्रो संस्कृतियों में एमके विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर (सीडी 61, सीडी 42बी, सीडी 49बी, सीडी 31, किट और सीडी 71) में, एचएससी से परिपक्व एमकेएस तक मेगाकैरियोपॉइसिस के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। अपने बड़े आकार और कमजोरी के बावजूद, MKs ऊपर उल्लिखित सेल सतह मार्कर का उपयोग कर इम्यूनोफेनोटाइप किया जा सकता है और फ्लोरेसेंस द्वारा समृद्ध-दबाव और नोजल व्यास की विशिष्ट परिस्थितियों में सेल टूटना और/ यह तकनीक मानव स्वास्थ्य और रोग में मेगाकारियोपोसिस और प्लेटलेट उत्पादन की जटिलता को बेहतर ढंग से समझने के उद्देश्य से बहु-ओमिक्स दृष्टिकोणों की सुविधा प्रदान करती है। उल्लेखनीय है, यह बढ़ती मांग के नैदानिक संदर्भ में निदान और पूर्वानुमान सहायता के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में पेश करेगा।
इस पांडुलिपि में हम प्राथमिक स्रोतों से एमके-विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर को एकीकृत करने वाले पैनल के साथ मानव मेगाकैरियोपोइसिस को मंचित करने या विट्रो मेंउत्पन्न करने की रणनीति का दस्तावेजीकरण करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टर, पसंदीदा अंशों और परिपक्व एमकेएस(चित्र 1)के साथ सॉर्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह कदम लोकप्रिय नहीं है, क्योंकि एमकेएस के बड़े आकार और कमजोरी के कारण यह तकनीकी रूप से मुश्किल है। हालांकि, इसे पहले माउस और मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में नियोजित किया गया है, और तकनीकी उन्नति के कारण, हर बार16,17,18बेहतर परिणाम के साथ। मानव प्राथमिक स्रोत जहां एमकेएस या एमके अग्रदूतों का अध्ययन किया जा सकता है, उनमें बोन मैरो, कॉर्ड ब्लड और परिधीय रक्त शामिल हैं। प्रत्येक नमूने पर विश्लेषण के लिए प्रासंगिक सेल अंश को अलग करने के लिए उचित नमूना प्रसंस्करण महत्वपूर्ण है। मेगाकारियोपोइसिस के अध्ययन पर लक्ष्य रखते समय कुछ विचारों के साथ मानक प्रक्रियाओं को शामिल किया जाता है।
प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मेगाकैरियोपॉजिस के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने वाले अधिकांश शोध केवल वंश-विशिष्ट सतह मार्कर(यानी,सीडी 42ए/सीडी 42बी, सीडी 41/सीडी61) का उपयोग करके एमके सबसेट की पहचान तक सीम?…
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए मार्कोस पेरेज बैस्टररेचेया, लोरेना रोड्रिगेज लोरेंजो और बेगोना गार्सिया मेंडेज़ (एचयूसीए) और पालोमा सेरेज़ो, अलमुडेना पेएरो और मारिया डी ला पोवेद-कोलोमो (एचसीएससी) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को आंशिक रूप से चिकित्सा अनुदान (Roche SP200221001) द्वारा A.B., एक RYC फैलोशिप (RYC-2013-12587) के लिए समर्थित किया गया था; मिनिस्टरियो डी इकोनी वाई प्रतिस्पर्धी, स्पेन) और एक आई + डी 2017 अनुदान (SAF2017-85489-P; मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिडेस, स्पेन और फोडोस फेडरर) एलजी, एक सेवरो ओचोआ ग्रांट (पीए-20-पीएफ-बीपी19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades डेल प्रिंसिपाडो डी Asturias, स्पेन) पी.M-बी के लिए और एक इंट्राम्यूरल पोस्टडॉक्टोरल ग्रांट 2018 (फंडासिओन पैरा ला इन्वेस्टिगासिओन वाई ला इनोवासिओन बायोसांइटारिया डी एस्टुरियस – फिनबा, ओविडो, स्पेन) से एए-एच। हम अपने ज्ञान (और समय) को साझा करने के लिए Reinier वान डेर लिंडेन का शुक्रिया अदा करते हैं, विशेष रूप से बहु-रंग टैग-एंटीबॉडी पैनल मिश्रण और एकल रंग मनका नियंत्रण तैयारी पर उनकी बुद्धिमान सलाह।
130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
To obtain PBMCs | |||
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
Flow Cytometry Analyses | |||
Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
RNAse | Merck | R6513 | or similar |
Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
Cell strainers for sorting | |||
CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. |