Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования для характеристики дифференцировки мегакариоцитов и показываем, как эта стратегия позволяет сортировать мегакариоциты на разных стадиях с помощью флуоресцентно-активированного сортировщика клеток. Методика может быть применена к первичным тканям человека, а также к мегакариоцитам, образуемым в культуре in vitro.
Дифференцировка мегакариоцитов (МК) охватывает ряд эндомитотических циклов, которые приводят к высокополиплоидной (достигающей еще >64N) и чрезвычайно большой клетке (40-60 мкм). В отличие от быстро растущих знаний о мегакариопоэсисе на клеточном биологии и молекулярном уровне, характеристика мегакариопоэтиса с помощью проточной цитометрии ограничивается идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров, в то время как более ранние стадии дифференцировки МК остаются неисследованными. Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования, которая позволяет идентифицировать последовательные стадии дифференцировки МК с возрастающим статусом плоидности в первичных источниках человека или культурах in vitro с панелью, объединяющей специфические и неспецифические поверхностные маркеры МК. Несмотря на свои размеры и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутой панели и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток при определенных условиях давления и диаметра сопла. Этот подход облегчает мультиомические исследования с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов у людей. Лучшая характеристика мегакариопоэтиса может представлять собой фундаментальную в диагностике или прогнозе связанных с линией патологий и злокачественных новообразований.
Мегакариоциты (МК) развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после сложного процесса, называемого мегакариопоэзом, который управляется в основном гормоном тромбопоэтином (ТПО). Классический взгляд на мегакариопоэтизис описывает клеточное путешествие от ГСК через последовательность иерархических стадий преданных предшественников и клеток-предшественников, что в конечном итоге приводит к зрелому МК. Во время созревания МК испытывают множественные раунды эндомитоза, развивают сложную внутриклеточную демаркационную мембранную систему (ДМС), которая обеспечивает достаточную поверхность мембраны для производства тромбоцитов, и эффективно производят и упаковывают множество факторов, которые содержатся в различных гранулах, унаследованных зрелыми тромбоцитами1,2,3. В результате зрелые МК представляют собой крупные клетки (40-60 мкм), характеризующиеся высокополиплоидным ядром (достигающим даже >64N). Недавние исследования предлагают альтернативные пути, по которым ГСК дифференцируются в МК, минуя традиционные контрольные точки приверженности линии в ответ на определенные физио-патологические состояния4,5,6,7,8,9,10,11. Эти результаты подчеркивают, что гемопоэтическая дифференциация в сторону зрелого МК является континуумным и адаптивным процессом, который реагирует на биологические потребности.
С ростом знаний о клеточной биологии и молекулярных аспектах, характеризующих мегакариопоэзис12,большинство исследований, посвященных изучению процесса с помощью проточной цитометрии, ограничены идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров(т. Е. CD42A / B, CD41 / CD61), в то время как более ранние этапы дифференцировки МК остаются неисследованными. Ранее мы задокументировали стратегию постановки мегакариопоэсиса в культурах MK13,14,полученных из костного мозга мышей и костного мозга, которую мы адаптировали и применили к людям15. В настоящей статье показана стратегия иммунофенотипирования, позволяющая характеризовать мегакариопоэтоз, от ГСК до зрелых МК, в первичных источниках человека (костном мозге -BM- и периферической крови -PB-) или культурах in vitro с использованием панели, интегрирующей специфические и неспецифические поверхностные маркеры MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT и CD71, среди прочих). Несмотря на свой большой размер и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутых маркеров клеточной поверхности и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток в определенных условиях давления и диаметра сопла для минимизации разрыва и / или повреждения клеток. Этот метод облегчает мультиомические подходы с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов в здоровье и болезнях человека. Примечательно, что он будет представлять собой полезный инструмент для облегчения диагностики и прогнозирования в клиническом контексте растущего спроса.
В этой рукописи мы документируем стратегию постановки человеческого мегакариопоизиса с помощью панели, объединяющей МК-специфические и неспецифические поверхностные маркеры из первичных источников или сгенерированные in vitro. Кроме того, мы предоставляем протокол для сортировки с помощью сортировщика клеток, активируемого флуоресценцией, предпочтительных фракций и зрелых МК(рисунок 1). Этот шаг не популярен, так как технически сложен из-за больших размеров и хрупкости МК. Тем не менее, он использовался как в образцах костного мозга мышей, так и человека ранее, и благодаря технологическому прогрессу, с лучшим результатом каждый раз16,17,18. Человеческие первичные источники, где могут быть изучены MK или предшественники MK, включают костный мозг, пуповинную кровь и периферическую кровь, среди прочего. Правильная обработка образца для выделения соответствующей клеточной фракции для анализа на каждом образце имеет важное значение. Включены стандартные процедуры, с некоторыми соображениями, которые следует учитывать при изучении мегакариопоизиса.
Большинство исследований, сосредоточенных на изучении мегакариопоэзиса с помощью проточной цитометрии, на сегодняшний день ограничены идентификацией подмножеств МК с использованием только специфических для линии поверхностных маркеров(т.е.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), в то время как более р…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Маркоса Переса Бастерречеа, Лорену Родригес Лоренцо и Бегонью Гарсию Мендес (HUCA) и Палому Сересо, Альмудену Пайеро и Марию де ла Поведа-Коломо (HCSC) за техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана медицинскими грантами (Roche SP200221001) для A.B., стипендии RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и грант I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания и Fondos FEDER) Л.Г., грант Северо Очоа (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spain) до P.M.-B. и очный постдокторский грант 2018 года (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spain) для A.A.-H. Мы благодарим Рейнира ван дер Линдена за то, что он поделился своими знаниями (и временем), особенно за его мудрые советы по многоцветной смеси антител с меткими антителами и подготовке к контролю над одноцветными шариками.
130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
To obtain PBMCs | |||
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
Flow Cytometry Analyses | |||
Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
RNAse | Merck | R6513 | or similar |
Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
Cell strainers for sorting | |||
CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. |