Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos
Summary
Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.
Abstract
La diferenciación de megacariocitos (MK) abarca una serie de ciclos enddomíticos que dan lugar a una célula altamente poliploide (que alcanza incluso >64N) y extremadamente grande (40-60 μm). En oposición al conocimiento de rápido aumento en megakaryopoiesis en la biología celular y el nivel molecular, la caracterización del megakaryopoiesis por cytometry de flujo se limita a la identificación de MKs maduros usando marcadores superficiales linaje-específicos, mientras que las etapas anteriores de la diferenciación de MK siguen siendo inexploradas. Aquí, presentamos una estrategia de immunophenotyping que permita la identificación de las etapas sucesivas de la diferenciación del MK, con la situación ploidy cada vez mayor, en fuentes primarias humanas o culturas ines vitro con un panel que integra los marcadores superficiales específicos y no específicos del MK. A pesar de su tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser inmunofenotipadas usando el panel antes mencionado y enriquecidas por la clasificación celular activada por fluorescencia bajo condiciones específicas de presión y diámetro de boquilla. Este enfoque facilita los estudios multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en los seres humanos. Una mejor caracterización del megakaryopoiesis puede plantear fundamental en la diagnosis o el pronóstico de patologías y de malignidad linaje-relacionadas.
Introduction
Los megacariocitos (MKs) se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas (HSCs) siguiendo un proceso complejo llamado megacariopoyesis, que es orquestado principalmente por la hormona trombopoyetina (TPO). La visión clásica de la megacariopoyesis describe el viaje celular desde las HSCs a través de una sucesión de etapas jerárquicas de progenitores comprometidos y células precursoras, lo que conduce en última instancia a un MK maduro. Durante la maduración, los MKs experimentan múltiples rondas de endomitosis, desarrollan un intrincado sistema de membrana de demarcación intracelular (DMS), que proporciona suficiente superficie de membrana para la producción de plaquetas, y producen y empaquetan eficientemente la plétora de factores que están contenidos en los diferentes gránulos heredados por las plaquetas maduras1,2,3. Como resultado, los MKs maduros son células grandes (40-60 μm) caracterizadas por un núcleo altamente poliploide (alcanzando incluso >64N). Estudios recientes sugieren rutas alternativas por las cuales las HSCs se diferencian en MKs evitando los puntos de control de compromiso de linaje tradicional en respuesta a ciertas condicionesfisiopatológicas4,5,6,7,8,9,10,11. Estos hallazgos ponen de relieve que la diferenciación hematopoyética hacia el MK maduro es un proceso continuo y adaptativo que responde a las necesidades biológicas.
Con el creciente conocimiento sobre la biología celular y los aspectos moleculares que caracterizan la megacariopoyesis12,la mayor parte de las investigaciones dedicadas al estudio del proceso por citometría de flujo se limitan a la identificación de MKs maduros utilizando marcadores de superficie específicos del linaje(es decir, CD42A/B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación mk permanecen inexploradas. Hemos documentado previamente una estrategia para escenificar megacariopoyesis en cultivos de MK derivados de la médula ósea de ratón y de la médula ósea13,14,que hemos adaptado y aplicado a los seres humanos15. En el presente artículo mostramos una estrategia de inmunofenotipificación que permite la caracterización de megacariopoyesis, desde HSCs hasta MKs maduros, en fuentes primarias humanas (médula ósea -BM- y sangre periférica -PB-) o cultivos in vitro mediante un panel que integra marcadores de superficie específicos e inespecíficos (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT y CD71, entre otros). A pesar de su gran tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser immunophenotyped usando los marcadores antedichos de la superficie de la célula y enriquecidos por la clasificación fluorescencia-activada de la célula bajo condiciones específicas del diámetro de la presión y de la boquilla para reducir al mínimo la ruptura y/o el daño de la célula. Esta técnica facilita los enfoques multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en la salud humana y la enfermedad. Cabe destacar que se planteará como una herramienta útil para ayudar al diagnóstico y pronóstico en un contexto clínico de creciente demanda.
En este manuscrito documentamos una estrategia para escenificar la megacariopoyesis humana con un panel que integra marcadores de superficie mk-específicos e inespecíficos de fuentes primarias o generadas in vitro. Además, proporcionamos un protocolo para clasificar, con un clasificador de células activado por fluorescencia, las fracciones preferidas y MKs maduros(Figura 1). Este paso no es popular, ya que es técnicamente difícil debido al gran tamaño y la fragilidad de los MKs. Sin embargo, se ha empleado tanto en muestras de ratón como de médula ósea humana con anterioridad, y debido al avance tecnológico, con un mejor resultado cada vez16,17,18. Las fuentes primarias humanas donde se pueden estudiar los precursores de MKs o MK incluyen médula ósea, sangre del cordón umbilical y sangre periférica, entre otras. El procesamiento adecuado de la muestra para aislar la fracción celular relevante para el análisis en cada muestra es de importancia. Se incorporan procedimientos estándar, con algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de apuntar al estudio de la megacariopoyesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayor parte de la investigación centrada en el estudio de la megacariopoyesis por citometría de flujo se limita hasta la fecha a la identificación de subconjuntos de MK utilizando sólo marcadores de superficie específicos del linaje(es decir,CD42A/CD42B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación de MK han sido mal examinadas. En el actual artículo mostramos una estrategia immunophenotyping para dirigir una caracterización cytometry de flujo comprensiva del megakaryopoiesis human…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo y Begoña García Méndez (HUCA) y Paloma Cerezo, Almudena Payero y María de la Poveda-Colomo (HCSC) por su apoyo técnico. Este trabajo fue parcialmente apoyado por medical grants (Roche SP200221001) a A.B., una beca RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, España) y una beca I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, España y Fondos FEDER) a L.G., beca Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, España) a P.M.-B. y una beca postdoctoral intramuros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, España) a A.A.-H. Agradecemos a Reinier van der Linden por compartir su conocimiento (y tiempo), especialmente su sabio consejo sobre la mezcla de paneles de anticuerpos etiquetados multicolor y la preparación para el control de perlas de un solo color.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Referências
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