Immunofenotypning och cellsortering av mänskliga MK från mänskliga primära källor eller differentierad in vitro från hematopoetiska stamceller
Summary
Här presenterar vi en immunophenotypning strategi för karakterisering av megakaryocyte differentiering, och visar hur den strategin tillåter sortering av megakaryocyter i olika stadier med en fluorescensaktiverad cell sortera. Metoden kan tillämpas på mänskliga primära vävnader, men också på megakaryocyter som genereras i kultur in vitro.
Abstract
Megakaryocyt (MK) differentiering omfattar ett antal endomitotiska cykler som resulterar i en mycket polyploid (når även >64N) och extremt stor cell (40-60 μm). I motsats till den snabbt ökande kunskapen i megakaryopoiesis på cellbiologi och molekylär nivå är karakteriseringen av megakaryopoiesis av flödescytometri begränsad till identifiering av mogna MKs med hjälp av härstamningsspecifika ytmarkörer, medan tidigare MK-differentieringsstadier förblir outforskade. Här presenterar vi en immunophenotypning strategi som gör det möjligt att identifiera successiva MK differentiering stadier, med ökande ploidy status, i mänskliga primära källor eller in vitro kulturer med en panel som integrerar MK specifika och icke-specifika ytmarkörer. Trots sin storlek och bräcklighet kan MKs immunofenotypas med hjälp av ovannämnda panel och berikas av fluorescensaktiverad cellsortering under specifika tryckförhållanden och munstyckesdiameter. Detta tillvägagångssätt underlättar multi-Omics studier, med målet att bättre förstå komplexiteten i megakaryopoiesis och trombocytproduktion hos människor. En bättre karakterisering av megakaryopoiesis kan utgöra grundläggande i diagnos eller prognos av härstamning-relaterade patologier och malignitet.
Introduction
Megakaryocyter (MKs) utvecklas från hematopoetiska stamceller (HSCs) efter en komplex process som kallas megakaryopoiesis, som främst orkestreras av hormonet trombopoietin (TPO). Den klassiska synen på megakaryopoiesis beskriver den cellulära resan från HSCs genom en följd av hierarkiska stadier av engagerade stamceller och föregångare celler, vilket i slutändan leder till en mogen MK. Under mognad upplever MKs flera omgångar av endomitosis, utveckla ett invecklat intracellulärt avgränsningssystem (DMS), som ger tillräckligt med membranyta för trombocytproduktion och effektivt producera och packa den mängd faktorer som finns i de olika granulerna som ärvs av mogna trombocyter1,2,3. Som ett resultat är mogna MKs stora celler (40-60 μm) som kännetecknas av en mycket polyploid kärna (når även >64N). Nyligen genomförda studier tyder på alternativa vägar genom vilka HSCs skiljer sig åt i MKs kringgå traditionella härstamning åtagande checkpoints som svar på vissa fysio-patologiska villkor4,5,6,7,8,9,10,11. Dessa resultat belyser att hematopoetisk differentiering mot den mogna MK är en kontinuum och adaptiv process som svarar på biologiska behov.
Med den ökande kunskapen om cellbiologin och de molekylära aspekterna som kännetecknar megakaryopoiesis12, är det mesta av forskningen som ägnas åt studier av processen genom flödescytometri begränsad till identifiering av mogna MKs med hjälp av härstamningsspecifika ytmarkörer (dvs. CD42A / B, CD41 / CD61), medan tidigare MK-differentieringsstadier förblir outforskade. Vi dokumenterade tidigare en strategi för att iscensätta megakaryopoiesis i mus benmärg och benmärg-härledda MK kulturer13,14, som vi har anpassat och tillämpat på människor15. I den nuvarande artikeln visar vi en immunophenotypningsstrategi som gör det möjligt att karakterisera megakaryopoiesis, från HSCs till mogna MKs, i mänskliga primära källor (benmärg -BM- och perifert blod -PB-) eller in vitro-kulturer med hjälp av en panel som integrerar MK-specifika och icke-specifika ytmarkörer (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT och CD71, bland andra). Trots sin stora storlek och bräcklighet kan MKs immunofenotypas med hjälp av ovan nämnda cellytans markörer och berikas av fluorescensaktiverad cellsortering under specifika tryck- och munstyckesdiameter för att minimera cellbrott och / eller skador. Denna teknik underlättar multi-Omics metoder, med målet att bättre förstå komplexiteten i megakaryopoiesis och trombocyt produktion i människors hälsa och sjukdom. Anmärkningsvärt, det kommer att utgöra ett användbart verktyg för att hjälpa diagnos och prognos i ett kliniskt sammanhang av växande efterfrågan.
I detta manuskript dokumenterar vi en strategi för att iscensätta mänsklig megakaryopoiesis med en panel som integrerar MK-specifika och icke-specifika ytmarkörer från primära källor eller genererad in vitro. Dessutom tillhandahåller vi ett protokoll för sortering, med en fluorescensaktiverad cellsortering, de föredragna fraktionerna och mogna MKs (Figur 1). Detta steg är inte populärt, eftersom det är tekniskt svårt på grund av MKs stora storlek och bräcklighet. Det har dock använts både i mus- och mänskliga benmärgsprover tidigare, och på grund av teknisk utveckling, med ett bättre resultat varjegång 16,17,18. Mänskliga primära källor där MKs eller MK prekursorer kan studeras inkluderar benmärg, navelsträngsblod och perifert blod, bland annat. Korrekt provbehandling för att isolera den relevanta cellfraktionen för analys av varje prov är av betydelse. Standardförfaranden införlivas, med vissa överväganden att ta hänsyn till när man siktar på studien av megakaryopoiesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mesta av forskningen som fokuserar på studier av megakaryopoiesis genom flödescytometri är hittills begränsad till identifiering av MK-undergrupper med endast härstamningsspecifika ytmarkörer (dvs.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), medan tidigare MK-differentieringssteg har undersökts dåligt. I den nuvarande artikeln visar vi en immunophenotyping strategi för att ta itu med ett omfattande flöde cytometri karakterisering av mänskliga megakaryopoiesis. Sammantaget vill vi lyfta fram nyttan av att kombiner…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo och Begoña García Méndez (HUCA) och Paloma Cerezo, Almudena Payero och María de la Poveda-Colomo (HCSC) för teknisk support. Detta arbete stöddes delvis av Medical Grants (Roche SP200221001) till A.B., ett RYC-stipendium (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) och ett I+D 2017-bidrag (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien och Fondos FEDER) till L.G., ett Severo Ochoa-anslag (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanien) till P.M.-B. och ett intramurala postdoktorala bidrag 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spanien) till A.A.-H. Vi tackar Reinier van der Linden för att han delar med sig av sina kunskaper (och tid), särskilt hans kloka råd om flerfärgs taggad antikroppspanelblandning och enfärgspärlakontrollpreparat.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Referências
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
