헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가
Summary
헤모필루스 인플루엔자는 호흡기에서 염증을 유발합니다. 이 기사에서는 이 박테리아에 대한 반응으로 식세포와 림프구에 의한 면역 반응을 정의하기 위해 유세포분석 및 컨포칼 현미경을 사용하는 방법에 중점을 둘 것입니다.
Abstract
헤모필루스 인플루엔자 (Hi)는 다양한 호흡기 질환에서 발견되는 널리 퍼진 박테리아입니다. 이 박테리아에 대한 호흡 면역/염증 반응을 평가하기 위해 다양한 분석/기술을 사용할 수 있습니다. 유세포분석 및 컨포칼 현미경은 생물학적 반응의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 형광 기반 기술입니다. 세포벽 성분, 사멸/불활성화 제제 및 살아있는 박테리아를 포함한 다양한 형태의 Hi 항원을 사용할 수 있습니다. Hi는 농축 배지가 필요한 까다로운 박테리아이지만 일반적으로 표준 실험실 환경에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 히히로 자극하기 위한 조직 샘플은 말초 혈액, 기관지 내시경 검사, 또는 절제된 폐 (예를 들어, 폐암의 치료를 위해 수술을 받는 환자에서)로부터 수득될 수 있다. 대식세포 및 호중구 기능은 식균작용, 활성 산소 종 및 세포내 사이토카인 생산을 포함하는 측정된 다양한 파라미터와 함께 유세포분석을 사용하여 포괄적으로 평가될 수 있다. 림프구 기능 (예를 들어, T 세포 및 NK 세포 기능)은 주로 세포내 시토카인 생산을 위해 유동 세포측정을 사용하여 특이적으로 평가될 수 있다. Hi 감염은 호중구 (NET)와 대 식세포 (MET) 모두에 의한 세포 외 트랩 생성의 강력한 유도제입니다. 컨포칼 현미경은 틀림없이 NET 및 MET 발현을 평가하는 가장 최적의 방법이며, 이는 프로테아제 활성을 평가하는 데에도 사용될 수 있습니다. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 폐 면역은 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다.
Introduction
헤모필루스 인플루엔자(Hi)는 대부분의 건강한 성인의 인두에 존재하는 정상적인 공생 박테리아입니다. 다당류 캡슐 (유형 A-F, 예를 들어, 유형 B 또는 HiB)을 갖거나 캡슐이 결여되어 있고 비유형 (NTHi)1일 수 있다. 이 박테리아에 의한 점막의 식민지화는 어린 시절부터 시작되며, 다른 식민지 균주의 회전율이 있습니다2. 이 박테리아는 또한 상부 및 하부 호흡기 모두를 침범 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 면역 반응및 염증 3,4의 활성화를 유도할 수 있다. 이 염증 반응은 임상 질환을 유발할 수 있으며 부비동염, 중이염, 기관지염, 낭포 성 섬유증, 폐렴 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함한 다양한 중요한 호흡기 상태에 기여할 수 있습니다. 이러한 조건의 대부분은 NTHi 균주2로 인한 것입니다. 이 기사에서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 Hi에 대한 호흡기 면역 반응을 평가하는 방법을 설명합니다.
하기에 기술된 방법들은 Hi에 대한 염증 반응을 평가하기 위해 변형된 잘 확립된 기술로부터 적응되었다. Hi의 적절한 항원 형태의 선택은 이러한 평가의 핵심 부분이다. 항원 제제는 세포벽 구성 요소에서 살아있는 박테리아에 이르기까지 다양합니다. 분석을 확립하고 표준화하기 위해 말초 혈액 샘플을 사용하는 것이 초기에 매우 도움이 될 수 있습니다.
유세포분석은 세포 수준에서 하나의 샘플에서 다양한 파라미터 및 기능 분석을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 또는 ELISspot과 같은 다른보다 일반적인 방법과 비교할 때 특정 세포 반응 (예 : 활성 산소 종 (ROS) 또는 세포 내 사이토 카인 생산)을 평가할 수 있다는 장점이 있습니다.
세포외 트랩은 호중구(NET)5,6,7 및 대식세포(MET)와 같은 다른 세포에 의해 발현됩니다.8. 그들은 특히 폐 9의 감염에서 주요 염증 반응으로 점점 더 인식되고있습니다. 이들은 컨포칼 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다. 이 기술은 NET/MET의 명확한 식별을 가능하게 하고 그 발현을 다른 형태의 세포 사멸과 구별합니다6.
유세포분석과 컨포칼 현미경은 모두 형광 기반 분석법입니다. 그들의 성공은 생물학적 샘플의 최적 변형 프로토콜에 달려 있습니다. 이러한 방법은 배우는 데 시간이 걸리며 적절한 감독 전문 지식이 필요합니다. 관련된 악기는 구매 및 운영 비용이 모두 비쌉니다. 그들의 사용을위한 최적의 설정은 주요 대학 및 3 차 위탁 병원을 포함합니다.
이 프로토콜에 사용 된 방법은 호흡기 질환과 관련된 다른 유사한 유기체 (예 : Moxarella catarrhalis 및 Streptococcus pneumoniae)의 연구를 위해 양도 할 수 있습니다. NTHi는 또한 다른 일반적인 호흡기 박테리아10과 상호 작용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 나열된 방법은 Hi에 대한 염증성 폐 반응에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 함께 사용할 수 있는 형광 기반 유동 세포분석 및 공초점 현미경 기술을 사용합니다.
사용되는 Hi의 적절한 항원 제형을 확립하는 것이 중요하며, 이와 관련하여 미생물학자로부터 구체적인 의견을 듣는 것이 좋습니다. Live Hi는 더 강한 반응을 유도하는 반면, 사멸 Hi 제제 및 Hi 구성 요소는 더 표…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 작업에 도움을 준 Monash Health의 임상 면역학 직원에게 감사드립니다.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
Referências
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
