Vurdering av respiratorisk immunrespons på Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae induserer betennelse i luftveiene. Denne artikkelen vil fokusere på bruk av flowcytometri og konfokalmikroskopi for å definere immunresponser av fagocytter og lymfocytter som respons på denne bakterien.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) er en utbredt bakterie som finnes ved en rekke luftveislidelser. En rekke forskjellige analyser / teknikker kan brukes til å vurdere respiratorisk immun / inflammatorisk respons på denne bakterien. Flowcytometri og konfokalmikroskopi er fluorescensbaserte teknologier som tillater detaljert karakterisering av biologiske responser. Ulike former for Hi-antigen kan brukes, inkludert celleveggkomponenter, drepte / inaktiverte preparater og levende bakterier. Hei er en kresen bakterie som krever berikede medier, men er generelt lett å dyrke i standard laboratorieinnstillinger. Vevsprøver for stimulering med Hi kan fås fra perifert blod, bronkoskopi eller resektert lunge (f.eks. hos pasienter som gjennomgår kirurgi for behandling av lungekreft). Makrofag og nøytrofil funksjon kan vurderes grundig ved hjelp av flowcytometri med en rekke parametere målt, inkludert fagocytose, reaktive oksygenarter og intracellulær cytokinproduksjon. Lymfocyttfunksjonen (f.eks. T-celle- og NK-cellefunksjon) kan vurderes spesifikt ved hjelp av flowcytometri, hovedsakelig for intracellulær cytokinproduksjon. Hei-infeksjon er en potent induktor av ekstracellulær felleproduksjon, både av nøytrofiler (NETs) og makrofager (METs). Konfokalmikroskopi er uten tvil den mest optimale måten å vurdere NET- og MET-uttrykk, som også kan brukes til å vurdere proteaseaktivitet. Lungeimmunitet mot Haemophilus influenzae kan vurderes ved hjelp av flowcytometri og konfokalmikroskopi.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) er en normal kommensale bakterie som finnes i svelget hos de fleste friske voksne. Hei kan ha en polysakkaridkapsel (type A-F, f.eks. type B eller HiB) eller mangle en kapsel og være ikke-typebar (NTHi)1. Kolonisering av slimhinnen med denne bakterien begynner i tidlig barndom, og det er en omsetning av forskjellige koloniserendestammer. Denne bakterien er også i stand til invasjon av både øvre og nedre luftveier; I denne sammenheng kan det indusere aktivering av immunresponsen og betennelse 3,4. Denne inflammatoriske responsen kan forårsake klinisk sykdom og bidra til en rekke viktige respiratoriske tilstander, inkludert bihulebetennelse, otitis media, bronkitt, cystisk fibrose, lungebetennelse og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOL). De fleste av disse forholdene skyldes NTHi-stammer2. Denne artikkelen vil beskrive metoder for å vurdere respiratoriske immunresponser mot Hi ved hjelp av flowcytometri og konfokalmikroskopi.
Metodene beskrevet nedenfor er tilpasset fra veletablerte teknikker som er modifisert for å vurdere inflammatorisk respons på Hi. Valget av en passende antigen form for Hi er en sentral del av denne vurderingen. Antigene preparater spenner fra celleveggkomponenter til levende bakterier. For å etablere og standardisere analyser, kan bruk av perifere blodprøver være svært nyttig i utgangspunktet.
Flowcytometri gjør det mulig å måle en rekke parametere og funksjonsanalyser fra en prøve på cellenivå. Denne teknikken har den fordelen at spesifikke cellulære responser (f.eks. produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) eller intracellulær cytokinproduksjon) kan vurderes sammenlignet med andre mer generelle metoder som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) eller ELISspot.
Ekstracellulære feller uttrykkes av nøytrofiler (NETs)5,6,7 og av andre celler som makrofager (METs)8. De blir i økende grad anerkjent som en viktig inflammatorisk respons, spesielt ved infeksjon i lungen9. De kan vurderes ved konfokal fluorescensmikroskopi. Denne teknikken tillater definitiv identifisering av NETS / MET og skiller deres uttrykk fra andre former for celledød6.
Både flowcytometri og konfokalmikroskopi er fluorescensbaserte analyser. Deres suksess er avhengig av optimale belastningsprotokoller for biologiske prøver. Disse metodene tar litt tid å lære og krever passende tilsynskompetanse. Instrumentene som er involvert er også dyre både å kjøpe og drive. Den optimale innstillingen for deres bruk inkluderer store universiteter og tertiære henvisningssykehus.
Metodene som brukes i denne protokollen er overførbare for studier av andre lignende organismer involvert i luftveissykdom (f.eks. Moxarella catarrhalis og Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerer også med andre vanlige respiratoriske bakterier10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som er oppført her bruker fluorescensbasert flowcytometri og konfokale mikroskopiteknikker som kan brukes sammen for å få detaljert informasjon om den inflammatoriske lungeresponsen på Hi.
Etablering av riktig antigenformulering av Hi som skal brukes er kritisk, og det anbefales å ha spesifikke innspill fra en mikrobiolog i denne forbindelse. Live Hi induserer en sterkere respons, mens drepte Hei-preparater og Heis-komponenter er mer standardiserte og er enklere å lagre. PI vil …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke personalet for klinisk immunologi ved Monash Health for deres hjelp med dette arbeidet.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
