Haemophilus influenzae inducerar inflammation i luftvägarna. Denna artikel kommer att fokusera på användningen av flödescytometri och konfokalmikroskopi för att definiera immunsvar av fagocyter och lymfocyter som svar på denna bakterie.
Haemophilus influenzae (Hi) är en utbredd bakterie som finns i en rad andningsbesvär. En mängd olika analyser/tekniker kan användas för att bedöma det respiratoriska immuna/inflammatoriska svaret på denna bakterie. Flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade tekniker som möjliggör detaljerad karakterisering av biologiska svar. Olika former av Hi-antigen kan användas, inklusive cellväggskomponenter, dödade / inaktiverade preparat och levande bakterier. Hej är en krånglig bakterie som kräver berikade medier men är i allmänhet lätt att odla i vanliga laboratoriemiljöer. Vävnadsprover för stimulering med Hi kan erhållas från perifert blod, bronkoskopi eller resekterad lunga (t.ex. hos patienter som genomgår kirurgi för behandling av lungcancer). Makrofag och neutrofil funktion kan utvärderas omfattande med hjälp av flödescytometri med en mängd olika parametrar uppmätta, inklusive fagocytos, reaktiva syrearter och intracellulär cytokinproduktion. Lymfocytfunktionen (t.ex. T-cells- och NK-cellfunktion) kan bedömas specifikt med hjälp av flödescytometri, främst för intracellulär cytokinproduktion. Hi-infektion är en potent inducerare av extracellulär fällproduktion, både av neutrofiler (NET) och makrofager (METs). Konfokalmikroskopi är utan tvekan det mest optimala sättet att bedöma NET- och MET-uttryck, som också kan användas för att bedöma proteasaktivitet. Lungimmunitet mot Haemophilus influenzae kan bedömas med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Haemophilus influenzae (Hi) är en normal kommensal bakterie som finns i svalget hos de flesta friska vuxna. Hi kan ha en polysackaridkapsel (typ A-F, t.ex. typ B eller HiB) eller sakna kapsel och vara icke-skrivbar (NTHi)1. Kolonisering av slemhinnan med denna bakterie börjar i tidig barndom, och det finns en omsättning av olika koloniserande stammar2. Denna bakterie kan också invasionen av både övre och nedre luftvägarna; I detta sammanhang kan det inducera aktivering av immunsvaret och inflammation 3,4. Detta inflammatoriska svar kan orsaka klinisk sjukdom och bidra till en mängd viktiga andningsbesvär, inklusive bihåleinflammation, otitis media, bronkit, cystisk fibros, lunginflammation och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). De flesta av dessa förhållanden beror på NTHi-stammar2. Denna artikel kommer att beskriva metoder för att bedöma respiratoriska immunsvar mot Hi med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs nedan har anpassats från väletablerade tekniker som har modifierats för att bedöma det inflammatoriska svaret på Hi. Valet av en lämplig antigenform av Hi är en viktig del av denna bedömning. Antigena preparat sträcker sig från cellväggskomponenter till levande bakterier. För att upprätta och standardisera analyser kan användningen av perifera blodprover vara till stor hjälp initialt.
Flödescytometri möjliggör mätning av en mängd olika parametrar och funktionella analyser från ett prov på cellulär nivå. Denna teknik har fördelen att specifika cellulära svar (t.ex. produktion av reaktiva syrearter (ROS) eller intracellulär cytokinproduktion) kan bedömas jämfört med andra mer allmänna metoder såsom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) eller ELISspot.
Extracellulära fällor uttrycks av neutrofiler (NET)5,6,7 och av andra celler såsom makrofager (METs)8. De erkänns alltmer som ett viktigt inflammatoriskt svar, särskilt vid infektion i lungan9. De kan bedömas med konfokal fluorescensmikroskopi. Denna teknik möjliggör definitiv identifiering av NET/METs och skiljer deras uttryck från andra former av celldöd6.
Både flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade analyser. Deras framgång är beroende av optimala töjningsprotokoll för biologiska prover. Dessa metoder tar lite tid att lära sig och kräver lämplig övervakningsexpertis. De inblandade instrumenten är också dyra både att köpa och driva. Den optimala inställningen för deras användning inkluderar stora universitet och tertiära remisssjukhus.
Metoderna som används i detta protokoll är överförbara för studier av andra liknande organismer som är involverade i andningssjukdomar (t.ex. Moxarella catarrhalis och Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerar också med andra vanliga andningsbakterier10.
Metoderna som listas här använder fluorescensbaserad flödescytometri och konfokalmikroskopitekniker som kan användas tillsammans för att få detaljerad information om det inflammatoriska lungsvaret på Hi.
Att fastställa lämplig antigenformulering av Hi som ska användas är avgörande, och det är lämpligt att ha specifik input från en mikrobiolog i detta avseende. Live Hi inducerar ett starkare svar, medan dödade Hi-preparat och Hi-komponenter är mer standardiserade och är lätta…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka personalen på Clinical Immunology på Monash Health för deras hjälp med detta arbete.
Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
CD49d | Thermofisher | 534048 | |
DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |