使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合
Summary
我们在这里介绍了一个程序，以测量蛋白质寡聚物和聚合在细胞溶解和活细胞使用荧光相关性光谱。
Abstract
蛋白质聚集是神经退行性疾病（如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）、帕金森病 （PD）、亨廷顿舞蹈症 （HD） 等的标志。为了检测和分析可溶性或扩散的蛋白质寡聚物或聚合物，已经使用了荧光相关光谱（FCS），它可以检测具有单分子灵敏度的单个粒子的扩散速度和亮度。然而，蛋白质聚合检测的适当程序和专有知识尚未得到广泛推广。在这里，我们展示了FCS测量细胞裂解和活细胞中容易聚集的蛋白质扩散特性的标准程序：TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa（TDP25）和超氧化物分解酶1（SOD1）的ALS相关25 kDa盒式终端片段。代表性结果表明，绿色荧光蛋白（GFP）标签TDP25的聚合部分被稍微包含在穆林神经母细胞神经母细胞核糖核酸的可溶性部分。此外，带有ALS相关突变的GFP标记SD1显示活细胞的扩散速度较慢。因此，我们介绍使用FCS通过其扩散特性检测蛋白质聚合的程序。
Introduction
蛋白质聚集涉及神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS），阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症等1 已知是有毒的，并会扰乱蛋白质平衡（蛋白酶），然后可能导致老化2。蛋白质聚集的清除有望作为一种治疗策略：然而，防止蛋白质聚集形成和降解蛋白质聚合物（如小分子或药物）的化学物质尚未确定。此外，蛋白质聚合如何产生毒性仍然难以捉摸。因此，为了促进与蛋白质聚集相关的研究项目，必须引入高吞吐量程序，以简单地检测蛋白质聚合。蛋白质聚合检测使用抗体识别蛋白质聚合和聚合特异性荧光染料的一致性已被广泛使用3。然而，很难检测聚合，特别是在使用这种经典程序的活细胞中。
弗斯特共振能量转移 （FRET） 是检测蛋白质聚合和结构变化的程序。然而，FRET无法分析蛋白质动力学（例如，活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化）3。因此，我们在这里引入了一个简单的协议，使用荧光相关光谱（FCS）检测溶液（如细胞裂解）和活细胞中的蛋白质聚合，该光谱学测量荧光分子的扩散特性和亮度，具有单分子灵敏度4。FCS 是一种使用激光扫描对焦显微镜 （LSM） 进行光子计数的方法。利用高度灵敏的光子探测器和光子到达时间的自相关函数（ACF）计算，测量检测体积中荧光分子的通过时间和亮度。随着分子量的增加，扩散速度变慢：因此，可以使用 FCS 估计分子间相互作用。更有力的是，荧光分子亮度的增加表明分子的同质化。因此，FCS 是检测此类蛋白质聚合的强大工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
关于测量前的系统校准，应使用与用于测量样品的玻璃器皿相同的玻璃器皿（例如，8 井盖玻璃室用于细胞测定，35 毫米玻璃底盘用于活细胞）。由于 Rh6G 吸附在玻璃上，其有效浓度有时可能会降低。如果是这样，应该只用于针孔调整的高度浓缩 Rh6G 解决方案，如 1 μM。必须避免极高的光子计数率以保护探测器（例如，超过 1000 kHz）。此外，集中解决方案不适用于获取自动关系功能（保持小于 100 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K.得到了日本科学促进会（JSPS）科研补助金（C）（#18K06201）的支持，得到了中田尼预防新型冠状病毒感染对策基金会的资助，得到了北海道大学未来研究领导者发展办公室（L-Station）的资助，以及Hoansha基金会的赠款援助。M. K. 部分得到了 JSPS 创新领域”多分子拥挤生物系统化学”（#20H04686）和 JSPS 创新领域”生物物质信息物理”（#20H05522）科学研究资助部分支持。
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
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