Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi
Summary
Vi introducerer her en procedure til måling af protein oligomerer og sammenlægning i celle lysat og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi.
Abstract
Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons Sygdom (HS) osv. For at detektere og analysere opløselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater er der anvendt fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektere diffusionshastigheden og lysstyrken af en enkelt partikel med en enkelt molekylefølsomhed. Den korrekte procedure og knowhow til registrering af proteinsammenlægning er imidlertid ikke blevet udbredt. Her viser vi en standardprocedure for FCS-måling for diffusionsegenskaber af aggregerings-tilbøjelige proteiner i celle lysat og levende celler: ALS-associeret 25 kDa carboxyl-terminalfragment af TAR DNA/ RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoxid dismutase 1 (SOD1). De repræsentative resultater viser, at en del af aggregaterne af grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket TDP25 var lidt inkluderet i den opløselige fraktion af murine neuroblastoma Neuro2a celle lysat. Desuden viser GFP-mærket SOD1 med ALS-associeret mutation en langsommere diffusion i levende celler. Derfor introducerer vi her proceduren til påvisning af proteinsammenlægningen via dens diffusionsegenskab ved hjælp af FCS.
Introduction
Proteinsammenlægninger, der involverer neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom og så videre1 er kendt for at være giftige og ville forstyrre proteinhomostase (proteostase) i celler og organer, som derefter kan føre tilaldring 2. Rydning af proteinsammenlægning forventes som en terapeutisk strategi; Der er dog endnu ikke etableret kemikalier, der forhindrer dannelse af proteinsammenlægning og nedbryder proteinaggregater (f.eks. små molekyler eller lægemidler). Desuden er det stadig vanskeligt at finde ud af, hvordan proteinsammenlægning udøver toksicitet. For at fremme forskningsprojekter i forbindelse med proteinsammenlægning er det derfor vigtigt at indføre procedurer for høj overførselshastighed for blot at detektere proteinsammenlægning. Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af antistoffer, der anerkender overensstemmelsen af proteinsammenlægning og aggregeringsspecifikt fluorescerende farvestof, er blevet anvendt i vid udstrækning3. Det er dog vanskeligt at opdage sammenlægningen, især i levende celler ved hjælp af sådanne klassiske procedurer.
Förster resonans energioverførsel (FRET) er en procedure til påvisning af proteinsammenlægning og strukturelle ændringer. FRET er imidlertid ikke i stand til at analysere proteindynamik (f.eks. diffusion og oligomerisering af protein i levende celler)3. Derfor introducerer vi her en simpel protokol til påvisning af proteinsammenlægning i opløsning (f.eks. celle lysat) og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som måler diffusionsegenskaben og lysstyrken af fluorescerende molekyler med enkeltmolekylefølsomhed4. FCS er en foton-tælle metode ved hjælp af en laserscanning confocal mikroskop (LSM). Ved hjælp af en meget følsom fotondetektor og beregning af autokorrelationsfunktion (ACF) af foton ankomsttid måles gennemløbstiden og lysstyrken af fluorescerende molekyler i detektionsvolumen. Diffusionen aftager med en forøgelse af molekylvægten; Således kan intermolekylær interaktion estimeres ved hjælp af FCS. Endnu mere kraftfuldt indikerer en stigning i lysstyrken af fluorescerende molekyle homo-oligomerisering af molekylerne. Derfor er FCS et kraftfuldt værktøj til at opdage en sådan proteinsammenlægning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hensyn til systemkalibrering før målinger bør der anvendes de samme glasvarer som det, der anvendes til måling af prøven (f.eks. skal glaskammeret med 8 brønde til cellelysat og 35 mm glasbasisretten til levende celler anvendes). På grund af adsorptionen af Rh6G på glasset kan dens effektive koncentration undertiden falde. Hvis det er tilfældet, bør en stærkt koncentreret Rh6G-opløsning som 1 μM kun anvendes til justering af pinhole. Ekstremt høje antal fotonhastigheder skal undgås for at beskytte dete…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. blev støttet af en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), af et tilskud-in-aid fra Nakatani Foundation for Countermeasures mod nye coronavirus infektioner, med et tilskud fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskud-in-aid fra Hoansha Foundation. M. K. blev delvist støttet af en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems” (#20H04686) og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Information physics of living matters” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
