Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Summary
Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.
Abstract
Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.
Introduction
Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter1 sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte2. Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregation Toxizität ausübt, schwer fassbar. Daher ist es zur Förderung von Forschungsprojekten im Zusammenhang mit der Proteinaggregation wichtig, Verfahren mit hohem Durchsatz einzuführen, um die Proteinaggregation einfach zu erkennen. Der Proteinaggregationsnachweis mit Antikörpern, die die Konformation von Proteinaggregation und aggregationsspezifischem Fluoreszenzfarbstoff erkennen, wurde weit verbreitet3. Es ist jedoch schwierig, die Aggregation zu erkennen, insbesondere in lebenden Zellen mit solchen klassischen Verfahren.
Förster Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Verfahren zur Erkennung von Proteinaggregation und Strukturwandel. FRET ist jedoch nicht in der Lage, die Proteindynamik zu analysieren (z. B. Diffusion und Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen)3. Daher führen wir hier ein einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinaggregation in Lösung (z.B. Zelllysat) und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ein, das die Diffusionseigenschaft und Helligkeit fluoreszierender Moleküle mit einzelmolekularer Empfindlichkeit4misst. FCS ist eine Photonenzählmethode mit einem Laserscan-Konfokalmikroskop (LSM). Mit Hilfe eines hochempfindlichen Photonendetektors und der Berechnung der Autokorrelationsfunktion (ACF) der Photonenankunftszeit wird der Durchlauf von Zeit und Helligkeit der Fluoreszenzmoleküle im Nachweisvolumen gemessen. Die Diffusion verlangsamt sich mit einer Erhöhung des Molekulargewichts; daher kann die intermolekulare Interaktion mit FCS geschätzt werden. Noch stärker ist, dass eine Erhöhung der Helligkeit des fluoreszierenden Moleküls auf eine Homo-Oligomerisierung der Moleküle hindeutet. Daher ist FCS ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine solche Proteinaggregation zu erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müss…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. wurde von einer Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), durch ein Stipendium der Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, durch ein Stipendium des Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) und ein Stipendium der Hoansha Foundation unterstützt. M. K. wurde teilweise durch ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems” (#20H04686) und ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Information Physics of living matters” (#20H05522) unterstützt.
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
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