Påvisning av proteinaggregering ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi
Summary
Vi introduserer her en prosedyre for å måle protein oligomerer og aggregering i cellelyse og levende celler ved hjelp av fluorescens korrelasjonsspektroskopi.
Abstract
Proteinaggregering er et kjennetegn på nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS) og så videre. For å oppdage og analysere løselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater, har fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som kan oppdage diffusjonshastigheten og lysstyrken til en enkelt partikkel med en enkelt molekylfølsomhet, blitt brukt. Imidlertid har riktig prosedyre og kunnskap for proteinaggregeringsdeteksjon ikke blitt mye delt. Her viser vi en standardprosedyre for FCS-måling for diffusjonsegenskaper av aggregasjonsutsatte proteiner i cellelyse og levende celler: ALS-assosiert 25 kDa karboksylterminalfragment av TAR DNA / RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoksiddismutase 1 (SOD1). De representative resultatene viser at en del av aggregater av grønt fluorescerende protein (GFP)-merket TDP25 var litt inkludert i den oppløselige brøkdelen av murin neuroblastom Neuro2a celle lysat. Videre viser GFP-merket SOD1 med ALS-assosiert mutasjon en langsommere diffusjon i levende celler. Følgelig introduserer vi her prosedyren for å oppdage proteinaggregering via diffusjonsegenskapen ved hjelp av FCS.
Introduction
Proteinaggregasjoner som involverer nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntington sykdom og så videre1 er kjent for å være giftige og vil forstyrre protein homeostase (proteostase) i celler og organer, som deretter kan føre tilaldring 2. Clearance av proteinaggregering forventes som en terapeutisk strategi; Imidlertid er kjemikalier som forhindrer proteinaggregasjonsdannelse og nedbrytningsproteinaggregater (f.eks. små molekyler eller legemidler) ikke fastslått ennå. Videre, hvordan proteinaggregasjon utøver toksisitet forblir unnvikende. Derfor, for å fremme forskningsprosjekter relatert til proteinaggregering, er det viktig å introdusere høy gjennomstrømningsprosedyrer for å bare oppdage proteinaggregering. Proteinaggregeringsdeteksjon ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner konformasjonen av proteinaggregasjon og aggregeringsspesifikk fluorescerende fargestoff har blitt mye brukt3. Det er imidlertid vanskelig å oppdage aggregasjonen, spesielt i levende celler ved hjelp av slike klassiske prosedyrer.
Förster resonans energioverføring (FRET) er en prosedyre for å oppdage proteinaggregering og strukturell endring. FRET er imidlertid ikke i stand til å analysere proteindynamikk (f.eks. diffusjon og oligomerisering av protein i levende celler)3. Derfor introduserer vi her en enkel protokoll for å oppdage proteinaggregering i løsning (f.eks. cellelysat) og levende celler ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som måler diffusjonsegenskapen og lysstyrken til fluorescerende molekyler med enkeltmolekylfølsomhet4. FCS er en fotontellingsmetode ved hjelp av et laserskanningskonfokalt mikroskop (LSM). Ved hjelp av en svært følsom fotondetektor og beregning av autokorrelasjonsfunksjon (ACF) av fotonankomsttid måles passeringstiden og lysstyrken til de fluorescerende molekylene i deteksjonsvolumet. Diffusjonen bremser med en økning av molekylvekten; Intermolekylær interaksjon kan derfor estimeres ved hjelp av FCS. Enda kraftigere indikerer en økning i lysstyrken til det fluorescerende molekylet homo-oligomerisering av molekylene. Derfor er FCS et kraftig verktøy for å oppdage slik proteinaggregering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når det gjelder systemkalibrering før målinger, bør de samme glassene som den som ble brukt til å måle prøven brukes (f.eks. 8-brønners dekselglasskammeret for cellelys og 35 mm glassbasefat for levende celler). På grunn av adsorpsjonen av Rh6G på glasset, kan den effektive konsentrasjonen noen ganger reduseres. I så fall bør en svært konsentrert Rh6G-løsning som 1 μM brukes bare til pinhole-justeringen. Ekstremt høye fotontellingshastigheter må unngås for å beskytte detektoren (f.eks. mer enn 1000 kHz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. ble støttet av en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av et tilskudd fra Nakatani Foundation for Countermeasures mot nye koronavirusinfeksjoner, ved et stipend fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskudd fra Hoansha Foundation. M. K. ble delvis støttet av en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems” (#20H04686), og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Information physics of living matters” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
