Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência
Summary
Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.
Abstract
A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.
Introduction
Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim pordiante 1 são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento2. Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agregação de proteínas exerce toxicidade permanece indescritível. Portanto, para promover projetos de pesquisa relacionados à agregação de proteínas, é importante introduzir procedimentos de alto rendimento para simplesmente detectar a agregação de proteínas. A detecção de agregação de proteínas usando anticorpos que reconhecem a conformação da agregação de proteínas e do corante fluorescente específico para agregação tem sido amplamente utilizada3. No entanto, é difícil detectar a agregação, especialmente em células vivas usando tais procedimentos clássicos.
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um procedimento para detectar agregação de proteínas e mudanças estruturais. No entanto, o FRET é incapaz de analisar a dinâmica proteica (por exemplo, difusão e oligomerização da proteína em células vivas)3. Por isso, introduzimos aqui um protocolo simples para detectar a agregação de proteínas em solução (por exemplo, lisato celular) e células vivas utilizando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que mede a propriedade de difusão e brilho de moléculas fluorescentes com sensibilidade de molécula única4. FCS é um método de contagem de fótons usando um microscópio confocal de varredura a laser (LSM). Utilizando um detector de fótons altamente sensível e o cálculo da função de autocorrelação (ACF) do tempo de chegada do fóton, a passagem pelo tempo e brilho das moléculas fluorescentes no volume de detecção é medida. A difusão diminui com o aumento do peso molecular; assim, a interação intermolecular pode ser estimada usando FCS. Ainda mais fortemente, um aumento no brilho da molécula fluorescente indica homo-oligomerização das moléculas. Portanto, a FCS é uma ferramenta poderosa para detectar tal agregação de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. foi apoiada por uma Sociedade Japonesa de Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), por uma subvenção da Fundação Nakatani para Contramedidas contra novas infecções por coronavírus, por uma bolsa do Escritório da Universidade de Hokkaido para o Desenvolvimento de Futuros Líderes de Pesquisa (L-Station), e uma subvenção da Fundação Hoansha. M. K. foi parcialmente apoiado por um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems” (#20H04686), e um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Information physics of living matters” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
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