Påvisande av proteinaggregering med fluorescenskorrelationsspektroskopi
Summary
Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.
Abstract
Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och så vidare. För att upptäcka och analysera lösliga eller diffusa proteinoligomer eller aggregat har fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektera diffusionshastigheten och ljusstyrkan hos en enda partikel med en enda molekylkänslighet, använts. Det korrekta förfarandet och know-how för proteinaggregeringsdetektering har dock inte delats i stor utsträckning. Här visar vi ett standardförfarande för FCS-mätning för diffusionsegenskaper hos aggregeringsbenägna proteiner i celllyat och levande celler: ALS-associerade 25 kDa karboxylterminalfragment av TAR DNA/ RNA-bindande protein 43 kDa (TDP25) och superoxiddemutas 1 (SOD1). De representativa resultaten visar att en del av aggregat av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt TDP25 var något ingår i den lösliga fraktionen av murin neuroblastom Neuro2a cell lysat. Dessutom visar GFP-märkta SOD1 bär ALS-associerade mutation en långsammare diffusion i levande celler. Följaktligen introducerar vi här proceduren för att upptäcka proteinaggregeringen via dess diffusionsegenskap med FCS.
Introduction
Proteinaggregeringar som involverar neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och såvidare 1 är kända för att vara giftiga och skulle störa proteinhomeostas (proteostas) i cellerna och organen, som sedan kan leda till åldrande2. Clearance av proteinaggregering förväntas som en terapeutisk strategi; Kemikalier som förhindrar proteinaggregeringsbildning och bryter ned proteinaggregat (t.ex. små molekyler eller läkemedel) har dock ännu inte fastställts. Dessutom är hur proteinaggregering utövar toxicitet fortfarande svårfångad. För att främja forskningsprojekt relaterade till proteinaggregering är det därför viktigt att införa förfaranden med hög genomströmning för att helt enkelt upptäcka proteinaggregering. Protein aggregering upptäckt med antikroppar som erkänner konformation av protein aggregering och aggregering-specifika fluorescerande färgämne har använts i stor utsträckning3. Det är dock svårt att upptäcka aggregeringen, särskilt i levande celler med sådana klassiska procedurer.
Förster resonans energiöverföring (FRET) är ett förfarande för att upptäcka proteinaggregering och strukturell förändring. FRET kan dock inte analysera proteindynamik (t.ex. diffusion och oligomerisering av protein i levande celler)3. Därför introducerar vi här ett enkelt protokoll för att upptäcka proteinaggregering i lösning (t.ex. celllyat) och levande celler med fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som mäter diffusionsegenskapen och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler med en molekylkänslighet4. FCS är en fotonräkningsmetod med hjälp av ett lsm(laser scan confocal microscope). Med hjälp av en mycket känslig fotondetektor och beräkning av autokorrelationsfunktion (ACF) av foton ankomsttid mäts genom tiden och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler i detektionsvolymen. Diffusionen saktar med en ökning av molekylvikten; Intermolecular interaktion kan således uppskattas med FCS. Ännu kraftfullare är att en ökning av ljusstyrkan hos den fluorescerande molekylen indikerar homo-oligomerisering av molekylerna. Därför är FCS ett kraftfullt verktyg för att upptäcka sådan proteinaggregering.
Protocol
Representative Results
Discussion
När det gäller systemkalibrering före mätningar bör samma glas som det som används för att mäta provet användas (t.ex. täcker 8-brunnarna glaskammaren för celllyat och 35 mm glasbasform för levande celler). På grund av adsorptionen av Rh6G på glaset kan dess effektiva koncentration ibland minska. I så fall bör en högkoncentrerad Rh6G-lösning som 1 μM användas endast för pinhole-justeringen. Extremt höga fotonantal måste undvikas för att skydda detektorn (t.ex. mer än 1000 kHz). Dessutom är den k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. stöddes av ett bidrag från Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av ett stöd från Nakatani Foundation for Countermeasures mot nya coronavirusinfektioner, genom ett bidrag från Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) och ett bidrag i bistånd från Hoansha Foundation. M. K. stöddes delvis av ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden “Kemi för multimolekylära crowdingbiosystem” (#20H04686) och ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden “Informationsfysik i levande frågor” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
