Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti
Summary
Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
Protein toplama, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) vb. Çözünür veya yaygın protein oligomerlerini veya agregalarını tespit etmek ve analiz etmek için, tek bir molekül hassasiyetine sahip tek bir parçacığın difüzyon hızını ve parlaklığını tespit debilen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, protein toplama tespiti için uygun prosedür ve know-how yaygın olarak paylaşılamamıştır. Burada, hücre lysate ve canlı hücrelerde toplama eğilimli proteinlerin difüzyon özellikleri için fcs ölçümünün standart bir prosedürünü gösteriyoruz: TAR DNA/ RNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP25) ve süperoksit dismutaz 1’in (SOD1) ALS ilişkili 25 kDa karboksil terminal parçası. Temsili sonuçlar, yeşil floresan protein (GFP) etiketli TDP25 agregalarının bir kısmının murine nöroblastom Neuro2a hücre lisatının çözünür kısmına biraz dahil edildiğini göstermektedir. Ayrıca, ALS ile ilişkili mutasyon taşıyan GFP etiketli SOD1 canlı hücrelerde daha yavaş bir difüzyon göstermektedir. Buna göre, burada FCS kullanarak difüzyon özelliği aracılığıyla protein toplamayı tespit etmek için prosedürü tanıtıyoruz.
Introduction
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukları içeren proteintoplamalarının toksik olduğu ve hücre ve organlarda protein homeostazını (proteostaz) rahatsız edeceği bilinmektedir, bu da yaşlanmaya yol açabilir2. Protein toplamanın temizlenmesi terapötik bir strateji olarak beklenmiştir; bununla birlikte, protein toplama oluşumunu engelleyen ve protein agregalarını bozan kimyasallar (örneğin, küçük moleküller veya ilaçlar) henüz tespit edilmiştir. Ayrıca, protein toplamanın toksisiteyi nasıl uyguladığı zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, protein toplama ile ilgili araştırma projelerini teşvik etmek için, protein toplamayı basitçe tespit etmek için yüksek verim prosedürlerinin getirilmesi önemlidir. Protein toplama ve toplama spesifik floresan boyanın konformasyonunu tanıyan antikorlar kullanılarak protein toplama tespiti yaygın olarak kullanılmıştır3. Bununla birlikte, özellikle bu tür klasik prosedürleri kullanarak canlı hücrelerde toplamayı tespit etmek zordur.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), protein toplama ve yapısal değişimi tespit etmek için yapılan bir prosedürdür. Bununla birlikte, FRET protein dinamiklerini analiz edemez (örneğin, canlı hücrelerde proteinin difüzyonu ve oligomerizasyonu)3. Bu nedenle, burada, tek molekül hassasiyetine sahip floresan moleküllerin difüzyon özelliğini ve parlaklığını ölçen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanarak çözeltideki (örneğin hücre lisat) ve canlı hücreleri tespit etmek için basit bir protokol sunuyoruz4. FCS, lazer tarama konfokal mikroskobu (LSM) kullanılarak yapılan foton sayma yöntemidir. Son derece hassas bir foton dedektörü ve foton varış süresinin otomatik ilişki işlevinin (ACF) hesaplanması kullanılarak, algılama hacmindeki floresan moleküllerin zaman ve parlaklığından geçiş ölçülür. Difüzyon moleküler ağırlığın artmasıyla yavaşlar; bu nedenle, intermoleküler etkileşim FCS kullanılarak tahmin edilebilir. Daha da güçlü bir şekilde, floresan molekülün parlaklığındaki artış moleküllerin homo-oligomerizasyonunu gösterir. Bu nedenle, FCS bu tür protein toplamayı tespit etmek için güçlü bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ölçümlerden önce sistem kalibrasyonu ile ilgili olarak, numuneyi ölçmek için kullanılanla aynı cam eşyalar kullanılmalıdır (örneğin, hücre lisat için 8 kuyulu kapak cam odası ve canlı hücreler için 35 mm cam taban kabı). Camdaki Rh6G adsorpsiyonu nedeniyle, etkili konsantrasyonu bazen azalabilir. Öyleyse, sadece iğne deliği ayarı için 1 μM gibi yüksek konsantre bir Rh6G çözeltisi kullanılmalıdır. Dedektörü korumak için son derece yüksek foton sayısı oranlarından kaçınılmalıdı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K., Japonya Bilim Geliştirme Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) (#18K06201), Nakatani Yeni Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Önlemler Vakfı’ndan hibe, Hokkaido Üniversitesi Gelecekteki Araştırma Liderlerini Geliştirme Ofisi ‘nden (L-Station) hibe ve Hoansha Vakfı’ndan bir hibe yardımı ile desteklendi. M. K., “Multimoleküler Kalabalık Biyosistemleri için Kimya” (#20H04686) yenilikçi alanlar üzerine bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid ve “Yaşamsal konuların bilgi fiziği” (#20H05522) üzerinde Bilimsel Araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklendi.
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
