Murine Pulmoner Kapakçığın Korelatif Görüntülemesi için Cerrahi ve Örnek İşleme
Summary
Burada, brüt uygunluğu ve lokal hücre dışı matris yapılarını belirlemek için murine pulmoner valfin eksizyon, basınçlandırma, fiksasyon ve görüntüleme için korelatif bir iş akışı açıklıyoruz.
Abstract
Kalp kapakçığı ile ilgili hastalığın (HVD) altında kalan nedenler zor bulunur. Murine hayvan modelleri HVD’yi incelemek için mükemmel bir araç sağlar, ancak yapıyı ve organizasyonu birden fazla uzunluk ölçeğinde doğru bir şekilde ölçmek için gereken cerrahi ve enstrümantal uzmanlık ilerlemesini engellemıştır. Bu çalışma, kalp kapakçığını farklı uzunluk ölçeklerinde tasvir etmek için murine diseksiyonu, en blok boyama, örnek işleme ve korelatif görüntüleme prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Hidrostatik transvalvüler basınç, kalp kapak konformasyonunu kimyasal olarak sabitlenerek zamansal heterojenliği kontrol etmek için kullanıldı. Kalp kapakçığının geometrisini doğrulamak ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) için gereken aşağı akış numune işleme için referans sağlamak için mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) kullanılmıştır. Hücre dışı matrisin (ECM) yüksek çözünürlüklü seri SEM görüntüleri alındı ve kuruluşunun yerel bir 3D gösterimini sağlamak için yeniden inşa edildi. Daha sonra pulmoner kapak boyunca mekansal varyasyonun üstesinden gelmek için μCT ve SBF-SEM görüntüleme yöntemleri korelasyona uğramıştır. Sunulan çalışma sadece pulmoner kapak üzerinde olmasına rağmen, bu metodoloji biyolojik sistemlerdeki hiyerarşik organizasyonu tanımlamak için benimsenebilir ve birden fazla uzunluk ölçeğinde yapısal karakterizasyon için çok önemlidir.
Introduction
Pulmoner kapak (PV), sağ ventrikül ile pulmoner arter arasında tek yönlü kan akışını sağlamaya yarar. Pulmoner kapak malformasyonları doğumsal kalp hastalığının çeşitli formları ile ilişkilidir. Konjenital kalp kapak hastalığının (HVD) mevcut tedavisi, bir hastanın ömrü boyunca birden fazla invaziv ameliyat gerektirebilen valvüler onarım veya kapak değişimidir1. Kalp kapakçığının işlevinin, genellikle yapı-fonksiyon korelasyon olarak adlandırılan yapısından türetildiği yaygın olarak kabul edilmiştir. Daha spesifik olarak, kalbin geometrik ve biyomekanik özellikleri işlevini belirler. Mekanik özellikler, sırayla, ECM’nin bileşimi ve organizasyonu tarafından belirlenir. Murine kalp kapakçıklarının biyomekanik özelliklerini belirlemek için bir yöntem geliştirerek, transgenik hayvan modelleri ECM’nin kalp kapak fonksiyonu ve disfonksiyonu üzerindeki rolünü sorgulamak için kullanılabilir2,3,4,5.
Murine hayvan modeli uzun zamandır moleküler çalışmalar için standart olarak kabul edilmektedir, çünkü transgenik modeller farelerde diğer türlere kıyasla daha hazırdır. Murine transgenik modeller kalp kapakçığı ile ilgili hastalıkları araştırmak için çok yönlü bir platform sağlar6. Bununla birlikte, hem geometriyi hem de ECM organizasyonunu karakterize etmek için cerrahi uzmanlık ve enstrümantasyon gereksinimleri, HVD araştırmalarının ilerlemesinde önemli bir engel olmuştur. Literatürdeki Hstolojik veriler, murine kalp kapakçığı hücre dışı matris içeriğine bir resim sağlar, ancak yalnızca 2B görüntüler şeklindedir ve 3D mimarisini tarif edemez7,8. Ek olarak, kalp kapakçığı hem mekansal hem de zamansal heterojendir, bu da örnekleme ve uygunluk düzeltilmezse ECM organizasyonu ile ilgili deneylerde sonuç çıkarmayı zorlaştırır. MRI veya 3D ekokardiyografi gibi geleneksel 3D karakterizasyon yöntemleri, ECM bileşenleri9,10’unçözümlenmesi için gerekli çözünürlüğü sağlamaz.
Bu çalışma, murine PV’nin hidrostatik transvalvüler basınçla uyumluluğunun sabitlenmesiyle kardiyak döngüye bağlı zamansal heterojenliğin ele alındığı tamamen korelatif bir iş akışını detaylandırmaktadır. Mekansal heterojenlik, ilgi çekici bölgeleri örneklemek ve farklı görüntüleme yöntemlerinden, özellikle μCT ve seri blok yüz tarama elektron mikroskopisinden farklı uzunluk ölçeklerinde veri setlerinin kaydedilmesiyle tam olarak kontrol edildi. Aşağı akış örneklemesine rehberlik etmek için μCT ile bu keşif yöntemi daha önce önerilmiştir, ancak pulmoner kapak zamansal varyasyon sergilediğinden, cerrahi seviye11’deek bir kontrol seviyesine ihtiyaç duyulmuştu.
Murine kalp kapak biyomekaniği tanımlayan in vivo çalışmalar seyrektir ve bunun yerine deformasyon davranışını tanımlarken hesaplamalı modellere dayanır. Nanometre uzunluğu ölçeğindeki yerel hücre dışı verilerin kalp kapakçığının geometrisi ve konumu ile ilgili olması kritik öneme sahiptir. Bu da, mevcut biyomekanik kalp kapak modellerini12, 13,14güçlendirmek için kullanılabilecek mekanik olarak katkıda bulunan ECM proteinlerinin ölçülebilir, mekansal olarak eşlenmiş dağılımlarını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventriküllerin çıkarılması iki amaca hizmet eder. Birincisi, ventrikül tarafını atmosferik basınca maruz bırakmak, böylece sadece akciğer kapakçığının arteryal tarafından kapanmak için bir transvalvüler basınç uygulamak gerekir ve ikincisi, pulmoner gövdenin bükülmesini önlemek için kararlı bir taban sağlar. Basınçlandırma sırasında, pulmoner gövde radyal ve alt yönden dağılır, bükülmeye eğilimli hale getirir ve pulmoner gövdenin çökmesine neden olur. Pulmoner vananın tuzlu s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen R01HL139796 ve R01HL128847 tarafından CKB ve RO1DE028297 ve DWM için CBET1608058 hibeleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
Referências
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
