Brug af næste generations sekventering til at identificere mutationer forbundet med reparation af et CAS9-induceret dobbeltstrengsbrud nær CD4-promotoren
Summary
Præsenteret her er sgRNA / CAS9 endonuklease og næste generations sekventeringsprotokol, der kan bruges til at identificere mutationerne forbundet med dobbeltstrengbrudsreparation nær CD4-promotoren.
Abstract
Dobbeltstrengsbrud (DSB’er) i DNA er den mest cytotoksiske type DNA-skade. Fordi et utal af fornærmelser kan resultere i disse læsioner (f.eks. Replikationsstress, ioniserende stråling, urepareret UV-skade), forekommer DSB’er i de fleste celler hver dag. Ud over celledød reducerer ureparerede DSB’er genomintegriteten, og de resulterende mutationer kan drive tumorgenese. Disse risici og forekomsten af DSB’er motiverer undersøgelser af de mekanismer, hvormed celler reparerer disse læsioner. Næste generations sekventering kan parres med induktion af DSB’er ved ioniserende stråling for at give et kraftfuldt værktøj til præcist at definere de mutationer, der er forbundet med DSB-reparationsfejl. Denne tilgang kræver imidlertid beregningsmæssigt udfordrende og omkostningsmæssigt uoverkommelig helgenomsekventering for at detektere reparationen af de tilfældigt forekommende DSB’er forbundet med ioniserende stråling. Sjældne skæreendonukleaser, såsom I-Sce1, giver mulighed for at generere en enkelt DSB, men deres genkendelsessteder skal indsættes i det genom, der er af interesse. Som følge heraf er reparationsstedet i sagens natur kunstigt. Nylige fremskridt gør det muligt for guide RNA (sgRNA) at lede en Cas9-endonuklease til ethvert genom-locus af interesse. Dette kan anvendes i studiet af DSB-reparation, der gør næste generations sekventering mere omkostningseffektiv ved at lade den fokusere på DNA’et, der flankerer den Cas9-inducerede DSB. Målet med manuskriptet er at demonstrere gennemførligheden af denne tilgang ved at præsentere en protokol, der kan definere mutationer, der stammer fra reparation af en DSB opstrøms for CD4-genet. Protokollen kan tilpasses for at bestemme ændringer i DSB’s mutagene potentiale forbundet med eksogene faktorer, såsom reparationshæmmere, viral proteinekspression, mutationer og miljøeksponeringer med relativt begrænsede beregningskrav. Når en organismes genom er blevet sekventeret, kan denne metode teoretisk anvendes på ethvert genomisk locus og i enhver cellekulturmodel af den organisme, der kan transfekteres. Lignende tilpasninger af tilgangen kan gøre det muligt at sammenligne reparationstroskab mellem forskellige loci i samme genetiske baggrund.
Introduction
Opretholdelse af genomisk stabilitet er afgørende for alle levende organismer. Nøjagtig DNA-replikation og et robust DNA-skaderespons (DDR) er nødvendige for trofast at udbrede det genetiske materiale 1,2. DNA-skader forekommer regelmæssigt i de fleste celler 2,3. Når disse skader mærkes, standses cellecyklusprogressionen, og DNA-reparationsmekanismer aktiveres. Dobbeltstrengsbrud i DNA eller DSB’er er den mest giftige og mutagene type DNA-skade 3,4.
Mens flere DDR-signalveje kan reparere disse læsioner, er de mest grundigt undersøgte DSB-reparationsveje homolog rekombination (HR) og ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ). HR er en stort set fejlfri vej, der reparerer en DSB ved hjælp af et søsterkromatid som en homolog skabelon. Dette har tendens til at ske i S-fasen og G2-fasen af en cellecyklus 5,6,7. NHEJ er mere fejlbehæftet, men det kan ske i hele cellecyklussen 8,9. Forskellige reporteranalyser er blevet udviklet til at måle effektiviteten af specifikke reparationsmekanismer 10,11,12. Disse assays har tendens til at stole på flowcytometri til en høj gennemstrømningsmåling af DSB-reparationsvejsaktivitet ved hjælp af GFP eller mCherry som en udlæsning11,13. Selvom de er meget effektive, er de afhængige af kanonisk reparation, der finder sted på et kunstigt introduceret DSB.
Der er en række andre metoder, der anvendes til at studere DSB-reparation. Mange af disse er afhængige af immunofluorescens (IF) mikroskopi 1,14. IF mikroskopi detekterer diskrete nukleare fokusområder, der er repræsentative for reparationskomplekser, efter at DSB’er er induceret ved eksponering for genotoksiske kemikalier eller ioniserende stråling15,16. Sporing af dannelsen og opløsningen af disse foci giver en indikation af reparationsinitiering og færdiggørelse, henholdsvis14,17. Disse metoder til DSB-induktion (dvs. kemikalier eller ioniserende stråling) forårsager imidlertid ikke DSB’er på definerede steder i genomet. Det er også funktionelt umuligt at bruge dem til konsekvent kun at fremkalde et lille antal (f.eks. 2-4) DSB’er. Som følge heraf forårsager de mest almindeligt anvendte metoder til at inducere DSB’er en lang række læsioner tilfældigt fordelt over hele genomet18. Et lille antal DSB’er kan introduceres ved at indsætte genkendelsesstedet for en sjælden skærende endonuklease og udtrykke den relevante endonuklease, såsom I-Sce119. Desværre forhindrer den nødvendige integration af et målsted undersøgelsen af DSB på endogene genomiske loci.
Dette manuskript beskriver en metode til at påvise mutationer i forbindelse med reparation af en DSB genereret på et brugerdefineret locus. Vi giver et repræsentativt eksempel på den tilgang, der anvendes til at vurdere et viralt proteins evne til at øge antallet af mutationer forbundet med en DSB. Specifikt beskriver dette manuskript brugen af et enkelt guide-RNA (sgRNA) til at lede en CAS9-endonuklease til at inducere en DSB ved human CD4 åben læseramme i humane forhudskekeratinocytter, der udtrykker vektorkontrol (HFK LXSN) og HFK, der udtrykker E6-proteinet af humant papillomavirus type 8 (HFK 8E6). Målrettet næste generations sekventering (NGS) af regionen omkring pausen gør det muligt at definere mutationer forbundet med reparation af læsionen strengt. Disse data viser, at virusproteinet forårsager en ca. 20 gange stigning i mutationer under DSB-reparation. Det giver også en upartisk karakterisering af de mutagene konsekvenser af DSB’er på et enkelt sted uden behov for helgenomsekventering. I princippet kunne protokollen let tilpasses til at sammenligne den relative risiko for mutationer mellem genomlodi eller cellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ud over dybden af de oplysninger, der gives, er der flere fordele ved denne metode. For det første kan DSB-reparation i teorien vurderes på ethvert genomisk loci uden at ændre genomet af den celle, der er af interesse. For det andet øges adgangen til NGS-analyse af reparation af de reducerede omkostninger og beregningsmæssige bestræbelser, der ydes ved at foretage og analysere en enkelt DSB målrettet mod et defineret område. Endelig, når genomerne fra yderligere organismer rutinemæssigt bliver tilgængelige, og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW og RP); National Cancer Institute of the National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; og det amerikanske forsvarsministerium (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi sætter pris på KSU-CVM Confocal Core og Joel Sanneman for vores immunofluorescensmikroskopi. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis disse finansieringsorganers officielle synspunkter.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
