Använda nästa generations sekvensering för att identifiera mutationer associerade med reparation av ett CAS9-inducerat dubbelsträngsbrott nära CD4-promotorn
Summary
Här presenteras sgRNA / CAS9-endonukleas och nästa generations sekvenseringsprotokoll som kan användas för att identifiera mutationerna i samband med reparation av dubbelsträngsbrott nära CD4-promotorn.
Abstract
Dubbelsträngsbrott (DSB) i DNA är den mest cytotoxiska typen av DNA-skador. Eftersom en myriad av förolämpningar kan resultera i dessa lesioner (t.ex. replikationsstress, joniserande strålning, oreparerad UV-skada), förekommer DSB i de flesta celler varje dag. Förutom celldöd minskar oreparerade DSB genomintegritet och de resulterande mutationerna kan driva tumorigenes. Dessa risker och förekomsten av DSB motiverar undersökningar av de mekanismer genom vilka celler reparerar dessa lesioner. Nästa generations sekvensering kan kombineras med induktion av DSB genom joniserande strålning för att ge ett kraftfullt verktyg för att exakt definiera mutationerna i samband med DSB-reparationsfel. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid beräkningsmässigt utmanande och kostnadsoöverkomlig helgenomsekvensering för att upptäcka reparationen av de slumpmässigt förekommande DSB: erna i samband med joniserande strålning. Sällsynta skärande endonukleaser, såsom I-Sce1, ger möjlighet att generera en enda DSB, men deras igenkänningsställen måste införas i genomet av intresse. Som ett resultat är reparationsplatsen i sig artificiell. Nya framsteg gör det möjligt för guide RNA (sgRNA) att rikta en Cas9-endonukleas till alla genomplatser av intresse. Detta kan tillämpas på studien av DSB-reparation som gör nästa generations sekvensering mer kostnadseffektiv genom att låta den fokuseras på DNA som flankerar den Cas9-inducerade DSB. Målet med manuskriptet är att visa genomförbarheten av detta tillvägagångssätt genom att presentera ett protokoll som kan definiera mutationer som härrör från reparationen av en DSB uppströms CD4-genen. Protokollet kan anpassas för att bestämma förändringar i den mutagena potentialen hos DSB associerad med exogena faktorer, såsom reparationshämmare, viralt proteinuttryck, mutationer och miljöexponeringar med relativt begränsade beräkningskrav. När en organisms genom har sekvenserats kan denna metod teoretiskt användas vid vilken genomisk plats som helst och i vilken cellodlingsmodell som helst av den organismen som kan transfekteras. Liknande anpassningar av tillvägagångssättet kan möjliggöra jämförelser av reparationstrohet mellan olika loci i samma genetiska bakgrund.
Introduction
Att upprätthålla genomisk stabilitet är avgörande för alla levande organismer. Noggrann DNA-replikation och ett robust DNA-skadesvar (DDR) är nödvändiga för att troget sprida det genetiska materialet 1,2. DNA-skador uppstår regelbundet i de flesta celler 2,3. När dessa skador känns av stoppas cellcykelprogressionen och DNA-reparationsmekanismer aktiveras. Dubbelsträngsbrott i DNA eller DSB är den giftigaste och mutagena typen av DNA-skador 3,4.
Medan flera DDR-signalvägar kan reparera dessa lesioner, är de mest grundligt studerade DSB-reparationsvägarna homolog rekombination (HR) och icke-homolog ändfogning (NHEJ). HR är en i stort sett felfri väg som reparerar en DSB med hjälp av en systerkromatid som en homolog mall. Detta tenderar att hända i S-fasen och G2-fasen i en cellcykel 5,6,7. NHEJ är mer felbenägen, men det kan hända under hela cellcykeln 8,9. Olika reporteranalyser har utvecklats för att mäta effektiviteten hos specifika reparationsmekanismer 10,11,12. Dessa analyser tenderar att förlita sig på flödescytometri för en mätning med hög genomströmning av DSB-reparationsvägsaktivitet med GFP eller mCherry som en avläsning11,13. Även om de är mycket effektiva förlitar de sig på kanonisk reparation som sker vid en artificiellt introducerad DSB.
Det finns en mängd andra metoder som används för att studera DSB-reparation. Många av dessa är beroende av immunofluorescens (IF) mikroskopi 1,14. OM mikroskopi detekterar diskreta kärnfoci som är representativa för reparationskomplex efter att DSB inducerats genom exponering för genotoxiska kemikalier eller joniserande strålning15,16. Spårning av bildandet och upplösningen av dessa foci ger en indikation på reparationsinitiering och slutförande, respektive14,17. Dessa metoder för DSB-induktion (dvs. kemikalier eller joniserande strålning) orsakar emellertid inte DSB på definierade platser i genomet. Det är också funktionellt omöjligt att använda dem för att konsekvent inducera endast ett litet antal (t.ex. 2-4) DSB. Som ett resultat orsakar de vanligaste metoderna för att inducera DSB en mängd lesioner slumpmässigt fördelade över hela genomet18. Ett litet antal DSB kan införas genom att införa igenkänningsstället för en sällsynt skärande endonukleas och uttrycka den relevanta endonukleasen, såsom I-Sce119. Tyvärr förhindrar den nödvändiga integrationen av ett målämne undersökningen av DSB vid endogena genomiska loci.
Detta manuskript beskriver en metod för att upptäcka mutationer associerade med reparationen av en DSB som genereras vid en användardefinierad plats. Vi ger ett representativt exempel på det tillvägagångssätt som används för att bedöma förmågan hos ett viralt protein att öka antalet mutationer associerade med en DSB. Specifikt beskriver detta manuskript användningen av ett enda guide-RNA (sgRNA) för att rikta en CAS9-endonukleas för att inducera en DSB vid human CD4 öppen läsram i humana förhudskeratinocyter som uttrycker vektorkontroll (HFK LXSN) och HFK som uttrycker E6-proteinet för humant papillomvirus typ 8 (HFK 8E6). Riktad nästa generations sekvensering (NGS) av regionen som omger pausen gör att mutationer i samband med reparationen av lesionen kan definieras noggrant. Dessa data visar att virusproteinet orsakar en cirka 20-faldig ökning av mutationer under DSB-reparation. Det ger också en opartisk karakterisering av de mutagena konsekvenserna av DSB vid en enda plats utan behov av helgenomsekvensering. I princip skulle protokollet lätt kunna anpassas för att jämföra den relativa risken för mutationer mellan genomlojningar eller cellinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förutom djupet av den information som tillhandahålls finns det flera fördelar med denna metod. För det första kan DSB-reparation i teorin bedömas vid vilken genomisk loci som helst utan att modifiera genomet hos den intressanta cellen. För det andra ökar tillgången till NGS-analys av reparation genom den minskade kostnaden och beräkningsinsatsen genom att göra och analysera en enda DSB riktad mot ett definierat område. Slutligen, med genomerna hos ytterligare organismer som rutinmässigt blir tillgängliga oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporteras i detta manuskript stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW och RP); Nationella cancerinstitutet vid National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; och USA:s försvarsdepartement (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi uppskattar KSU-CVM Confocal Core och Joel Sanneman för vår immunofluorescensmikroskopi. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis dessa finansieringsorgans officiella åsikter.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
