يقدم هذا البروتوكول سير عمل تجريبي كامل لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الملاقط البصرية. يتم تحديد العديد من الاجهزة التجريبية المحتملة بما في ذلك الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر confocal.
يعتمد الجيش الملكي النيبالي طيات هيكلية متنوعة ، والتي تعتبر ضرورية لوظائفه وبالتالي يمكن أن تؤثر على العمليات المتنوعة في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل بنية ووظيفة الحمض النووي الريبي من خلال عوامل مختلفة عابرة للمفعول ، مثل البروتينات أو الأيض أو الحمض النووي الريبي الآخر. فجزيئات الحمض النووي الريبي المتحولة الإطارية، على سبيل المثال، هي RNAs تنظيمية تقع في مناطق الترميز، والتي تترجم الريبوسومات مباشرة إلى إطار قراءة مفتوح بديل، وبالتالي تعمل كمفاتيح جين. كما أنها قد تعتمد طيات مختلفة بعد ربط البروتينات أو غيرها من العوامل العابرة. لتشريح دور البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي في الترجمة وكيفية تعديل هيكل واستقرار الحمض النووي الريبي ، من الأهمية بمكان دراسة التفاعل والسمات الميكانيكية لهذه المجمعات بروتين الحمض النووي الريبي في وقت واحد. يوضح هذا العمل كيفية استخدام ملاقط بصرية مقترنة بجزيء واحد لاستكشاف المناظر الطبيعية التوافقية والديناميكية الحرارية لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي بدقة عالية. وكمثال على ذلك، يتم تفصيل تفاعل عنصر نقل الإطارات الريبوسومية المبرمجة سارس-CoV-2 مع العامل العابر للمفعول القصير isoform من البروتين المضاد للفيروسات بإصبع الزنك. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد الريبوسومات ذات العلامات الفلورية باستخدام الوحدة الكونفوكوكال، التي ستمكن في نهاية المطاف من دراسة استطالة الترجمة. يمكن تطبيق المقايسة الفلورية المقترنة OT على نطاق واسع لاستكشاف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المتنوعة أو العوامل العابرة للمفعول التي تنظم الترجمة ويمكن أن تسهل دراسات تنظيم الجينات القائم على الحمض النووي الريبي.
نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي إلى البروتينات من خلال الحمض النووي الريبي هو عملية كيميائية حيوية معقدة، والتي يتم تنظيمها بدقة على جميع المستويات من خلال التفاعلات الجزيئية الكلية داخل الخلايا. للتنظيم الترجمي، تمنح التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين دورا حاسما للتفاعل بسرعة مع مختلف المحفزات والإشارات1,2. تؤثر بعض التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين على استقرار الحمض النووي الريبي وبالتالي تغير الوقت الذي يكون فيه الحمض النووي الريبي نشطا بشكل ترجمي. وترتبط التفاعلات الأخرى بين الحمض النووي الريبي والبروتين بآليات إعادة ترميز مثل إعادة معاينة وقف كودون، أو تجاوز، أو برمجة الريبوسومات frameshifting (PRF)3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة، تم إثبات عدد من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) للتفاعل مع عناصر مرنا التحفيزية وآلية الترجمة لإملاء متى وكم إعادة ترميز سيحدث في الخلية7،8،9،10،11. وهكذا، لتشريح دور البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي في الترجمة وكيف تعدل هيكل الجيش الملكي النيبالي والاستقرار، فمن المحوري لدراسة مبادئ التفاعل والخصائص الميكانيكية لهذه المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين بالتفصيل.
وقد أرست عقود من العمل الأساس لدراسة عملية الترجمة متعددة الخطوات والمتعددة المكونات، والتي تعتمد على التواصل المعقد بين الحمض النووي الريبي ومكونات البروتين في آلية الترجمة لتحقيق السرعة والدقة12,13,14. وتتمثل الخطوة الحاسمة التالية في فهم الأحداث التنظيمية المعقدة في تحديد القوى والجداول الزمنية والمحددات الهيكلية أثناء الترجمة بدقة عالية12,15,16,17. وقد تم تسليط الضوء على دراسة الديناميات تشكيل الحمض النووي الريبي وخاصة كيف تعمل العوامل المساعدة عبر المفعول على هيكل الجيش الملكي النيبالي أثناء الترجمة من خلال ظهور أدوات جزيء واحد، بما في ذلك ملاقط بصرية أو أدلة موجة وضع الصفر16،17،18،19،20،21،22،23،24 25,26
تمثل الملاقط البصرية (OT) تقنية جزيء واحد دقيقة للغاية ، والتي تم تطبيقها لدراسة أنواع عديدة من العمليات الديناميكية المعتمدة على الحمض النووي الريبي بما في ذلك النسخ والترجمة26،27،28،29،30،31،32. وقد سمح استخدام الملاقط البصرية التحقيق في التفاعلات الجزيئية، وهياكل الحمض النووي، والخصائص الحرارية، والحركية، وحيوية من هذه العمليات بالتفصيل16،17،22،33،34،35،36،37،38،39 . ويستند المقايسة ملاقط البصرية على الفخ من الأجسام المجهرية مع شعاع ليزر مركزة. في تجربة OT النموذجية ، يرتبط جزيء الاهتمام بين حبتين شفافتين (عادة البوليسترين) (الشكل 1A)27. ثم يتم القبض على هذه الخرز من قبل الفخاخ البصرية، والتي تتصرف مثل الينابيع. وهكذا، يمكن حساب القوة المطبقة على الجزيء على أساس إزاحة الخرزة من مركز شعاع الليزر المركز (مركز الفخ). في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر الكونفوج (الشكل 1B)، مما مكن من الفلورسينس أو Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) القياسات40،41،42. وهذا يفتح مجالا جديدا كليا للتجارب الممكنة التي تسمح بالقياس المتزامن، وبالتالي الارتباط الدقيق لبيانات التحليل الطيفي للقوة والفلورسينس.
هنا، ونحن نظهر التجارب باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع المجهر confocal لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تنظيم تحويل الإطارات المترجمة. بين الهدف والمكثف، خلية تدفق مع خمس قنوات تمكن التطبيق عينة مستمرة مع تدفق صفح. من خلال قنوات microfluidic ، يمكن حقن مكونات مختلفة مباشرة ، مما يقلل من الوقت العملي بالإضافة إلى السماح باستهلاك عينة قليلة جدا طوال التجربة.
أولا ، يقترح مبدأ توجيهي أساسي للمساعدة في تصميم تجارب OT ويتم مناقشة مزايا وكذلك مزالق الأجهزة المختلفة. بعد ذلك، يتم وصف إعداد العينات وسير العمل التجريبي، ويتم توفير بروتوكول لتحليل البيانات. لتمثيل مثال على ذلك، نوضح النتائج التي تم الحصول عليها من تجارب تمديد الحمض النووي الريبي لدراسة عنصر الحمض النووي الريبي المتحول من سارس-CoV-2 (الشكل 2A) مع عامل المفعول العابر للنمط القصير من البروتين المضاد للفيروسات بأصابع الزنك (ZAP)، والذي يغير ترجمة الحمض النووي الريبي الفيروسي من إطار قراءة بديل43. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ثبت أن الريبوسومات ذات العلامات الفلورية يمكن استخدامها في هذا الفحص الكونفوجال OT، والتي من شأنها أن تكون مفيدة لرصد عملية وسرعة آلات الترجمة. يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لاختبار تأثير المخازن المؤقتة المختلفة أو الليجاند أو المكونات الخلوية الأخرى بسرعة لدراسة جوانب مختلفة من الترجمة. وأخيرا، تتم مناقشة المزالق التجريبية الشائعة وكيفية استكشافها وإصلاحها. فيما يلي بعض النقاط الحاسمة في التصميم التجريبي موضحة.
تصميم البناء
من حيث المبدأ ، هناك نهجان مشتركان لإنشاء بناء الحمض النووي الريبي المتوافق مع OT. يستخدم النهج الأول جزيء الحمض النووي الريبي الطويل الذي يتم تهجينه مع مقابض الحمض النووي التكميلية ، مما يؤدي إلى بناء يتكون من منطقتين هجينتين من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي يحيطان بتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي التقطعت به السبل في الوسط (الشكل 2B). ويستخدم هذا النهج في معظم التجارب OT الجيش الملكي النيبالي33,44,45.
النهج الثاني يستفيد من مقابض dsDNA مع قصيرة (حوالي 20 NT) يتدلى15,17. ثم يتم تهجين هذه المعلقات مع جزيء الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن أكثر تعقيدا في التصميم، واستخدام مقابض dsDNA يتغلب على بعض القيود المفروضة على الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي الهجين النظام. من حيث المبدأ ، حتى مقابض طويلة جدا (>10kb) يمكن تنفيذها ، وهو أكثر ملاءمة لقياسات confocal. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ربط جزيء الحمض النووي الريبي بمقابض الحمض النووي لزيادة استقرار الحبل.
استراتيجية وضع العلامات النهائية
يجب ربط البناء بالخرز عن طريق تفاعل جزيئي قوي. في حين أن هناك نهج متاحة للترابط التكافؤي للمقابض إلى الخرز46 ، فإن التفاعلات القوية ولكن غير التكافؤية مثل streptavidin-biotin و digoxigenin-antibody تستخدم عادة في تجارب OT15،33،35،45. في البروتوكول الموصوف ، يتم تسمية البناء بالبيوتين أو الديجوكسيجينين ، والخرز مغلف بالستريبتافيدين أو الأجسام المضادة ضد الديجوكسيجينين ، على التوالي (الشكل 1A). وسيكون هذا النهج مناسبا لتطبيق القوات التي تصل إلى حوالي 60 pN (لكل حبل)47. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مختلف استراتيجيات وضع العلامات 5 و 3 ‘تسمح بتحديد اتجاه الحبل شكلت بين الخرز17.
وضع العلامات على البروتين لقياسات الفلورسينس
للتصوير الكونفوكوكال، هناك العديد من النهج الشائعة الاستخدام لعلامات الفلورسينس. على سبيل المثال، يمكن ربط الفلوروفوريس بشكل مشترك ببقايا الأحماض الأمينية الموجودة أصلا في البروتينات أو التي يتم إدخالها عن طريق تكوين الطفرات الموجه من الموقع من خلال مجموعة عضوية تفاعلية. يمكن استخدام الأصباغ الثيول أو أمين التفاعلية لتسمية بقايا السيستين واليسين، على التوالي. هناك العديد من طرق الحماية القابلة للعكس لزيادة خصوصية وضع العلامات48,49 ، ولكن عادة ما يتم تصنيف البروتينات الأصلية على بقايا متعددة. على الرغم من أن صغر حجم الفلوروفور قد يمنح ميزة، إلا أن وضع العلامات غير المحددة قد يتعارض مع نشاط البروتين وبالتالي قد تختلف كثافة الإشارة49. أيضا، اعتمادا على كثافة إشارة كفاءة وضع العلامات قد تختلف بين التجارب المختلفة. لذلك، يجب إجراء فحص نشاط قبل التجربة.
في حالة أن البروتين من الفائدة يحتوي على علامة N- أو C-المحطة الطرفية، مثل له العلامة أو بكتيريا العلامة، وسم محددة من هذه العلامات يمثل نهجا آخر شعبية. وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات المستهدفة يقلل من فرصة تدخل الفلوروفور في نشاط البروتين ويمكن أن يعزز قابلية الذوبان49. ومع ذلك، فإن وضع العلامات الخاصة بالعلامة عادة ما ينتج بروتينات أحادية الفلوروفورية، والتي قد يكون من الصعب اكتشافها. ويمكن تحقيق طريقة أخرى للوسم محددة من خلال استخدام الأجسام المضادة.
إعداد الموائع الدقيقة
مزيج من OT مع نظام microfluidics يسمح الانتقال السريع بين الظروف التجريبية المختلفة. وعلاوة على ذلك، تستفيد الأنظمة الحالية من الحفاظ على تدفق صفح داخل خلية التدفق، مما يحول دون خلط السوائل من قنوات أخرى في الاتجاه العامودي بالنسبة لاتجاه التدفق. لذلك ، فإن تدفق صفح مفيد بشكل خاص للتصميم التجريبي. حاليا، يتم استخدام خلايا التدفق مع ما يصل إلى 5 قنوات عادة (الشكل 3).
هنا، ونحن نظهر استخدام الملاقط البصرية المفلورة إلى جانب لدراسة التفاعلات والسلوك الديناميكي لجزيئات الحمض النووي الريبي مع مختلف ليغاندس. فيما يلي، تتم مناقشة الخطوات والقيود الهامة لهذه التقنية.
الخطوات الهامة في البروتوكول
أما بالنسبة للعديد من الطرق الأخر…
The authors have nothing to disclose.
نشكر أنوجا كيبي و جون البروفيسور ريدموند سميث على المراجعة النقدية للمخطوطة. نشكر تاتيانا كوخ على المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر كريستينا بيكاركوفا على المساعدة في تسجيل مقاطع الفيديو التجريبية. يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل جمعية هيلمهولتز وتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) غرانت nr. 948636 (إلى NC).
Bacterial Strains | |||
E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
Chemicals and enzymes | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
Kits | |||
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
Oligonucleotides | |||
5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
DNA vectors | |||
pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
Software and Algorithms | |||
Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
Bluelake | Lumicks | N/A | |
Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
Outro | |||
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
Devices | |||
C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |