Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.
RNA nimmt verschiedene strukturelle Falten an, die für ihre Funktionen essentiell sind und dadurch verschiedene Prozesse in der Zelle beeinflussen können. Darüber hinaus kann die Struktur und Funktion einer RNA durch verschiedene transaktive Faktoren wie Proteine, Metaboliten oder andere RNAs moduliert werden. Frameshifting-RNA-Moleküle zum Beispiel sind regulatorische RNAs in kodierenden Regionen, die Ribosomen direkt in einen alternativen offenen Leserahmen übersetzen und dadurch als Genschalter fungieren. Sie können auch verschiedene Falten annehmen, nachdem sie an Proteine oder andere Transfaktoren gebunden sind. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation zu analysieren und wie sie die RNA-Struktur und -Stabilität modulieren, ist es wichtig, das Zusammenspiel und die mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Protein-Komplexe gleichzeitig zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt, wie man mit einer einzelnen Molekül-Fluoreszenz-gekoppelten optischen Pinzette die Konformations- und thermodynamische Landschaft von RNA-Protein-Komplexen mit hoher Auflösung erforscht. Als Beispiel wird die Interaktion des SARS-CoV-2 programmierten ribosomalen Frameshifting-Elements mit der trans-wirkenden Faktor-Kurzisoform des antiviralen Zinkfingerproteins herausgearbeitet. Darüber hinaus wurden fluoreszenzmarkierte Ribosomen mit der konfokalen Einheit überwacht, was letztendlich die Untersuchung der Translationsdehnung ermöglichen würde. Der fluoreszenzgekoppelte OT-Assay kann weit verbreitet eingesetzt werden, um verschiedene RNA-Proteinkomplexe oder trans-wirkende Faktoren zu erforschen, die die Translation regulieren, und könnte Studien zur RNA-basierten Genregulation erleichtern.
Die Übertragung genetischer Information von DNA auf Proteine durch mRNAs ist ein komplexer biochemischer Prozess, der auf allen Ebenen durch makromolekulare Interaktionen innerhalb von Zellen präzise reguliert wird. Für die translationale Regulation spielen RNA-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle, um schnell auf verschiedene Reize und Signale zu reagieren1,2. Einige RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen die mRNA-Stabilität und verändern dadurch die Zeit, in der eine RNA translational aktiv ist. Andere RNA-Protein-Interaktionen sind mit Rekodierungsmechanismen wie Stop-Codon-Readthrough, Bypassing oder Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 assoziiert. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Reihe von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit stimulierenden mRNA-Elementen und der Translationsmaschinerie interagieren, um zu bestimmen, wann und wie viel Rekodierung in der Zelle stattfinden wird7,8,9,10,11. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation und deren Modulation der RNA-Struktur und -Stabilität zu analysieren, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Interaktionsprinzipien und mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Proteinkomplexe im Detail zu untersuchen.
Jahrzehntelange Arbeit hat den Grundstein für die Untersuchung des mehrstufigen und mehrkomponentigen Prozesses der Translation gelegt, der auf einer komplizierten Kommunikation zwischen den RNA- und Proteinkomponenten der Translationsmaschinerie beruht, um Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erreichen12,13,14. Ein entscheidender nächster Schritt zum Verständnis komplexer regulatorischer Ereignisse ist die Bestimmung der Kräfte, Zeitskalen und strukturellen Determinanten während der Translation mit hoher Genauigkeit12,15,16,17. Die Untersuchung der RNA-Konformationsdynamik und insbesondere wie trans-wirkende Hilfsfaktoren während der Translation auf die RNA-Struktur wirken, wurde durch das Aufkommen von Einzelmolekülwerkzeugen, einschließlich optischer Pinzetten oder Nullmodus-Wellenleiter, weiter beleuchtet16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optische Pinzetten (OT) stellen eine hochpräzise Einzelmolekültechnik dar, die angewendet wurde, um viele Arten von RNA-abhängigen dynamischen Prozessen einschließlich Transkription und Translation zu untersuchen26,27,28,29,30,31,32. Die Verwendung einer optischen Pinzette hat es ermöglicht, molekulare Wechselwirkungen, Nukleinsäurestrukturen und thermodynamische Eigenschaften, Kinetik und Energetik dieser Prozesse im Detail zu untersuchen16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Der optische Pinzetten-Assay basiert auf dem Einklemmen mikroskopischer Objekte mit einem fokussierten Laserstrahl. In einem typischen OT-Experiment wird das interessierende Molekül zwischen zwei transparenten (normalerweise Polystyrol-) Kügelchen gebunden (Abbildung 1A)27. Diese Perlen werden dann von optischen Fallen aufgefangen, die sich wie Federn verhalten. So kann die auf das Molekül ausgeübte Kraft basierend auf der Verschiebung der Perle aus dem Zentrum des fokussierten Laserstrahls (Fallenzentrum) berechnet werden. Kürzlich wurden optische Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie kombiniert (Abbildung 1B), was Fluoreszenz- oder Förster-Resonanzenergietransfermessungen (FRET) ermöglicht40,41,42. Dies eröffnet ein völlig neues Feld möglicher Experimente, die eine gleichzeitige Messung und damit eine präzise Korrelation von Kraftspektroskopie und Fluoreszenzdaten ermöglichen.
Hier demonstrieren wir Experimente mit der optischen Pinzette in Kombination mit konfokaler Mikroskopie, um Protein-RNA-Interaktionen zu untersuchen, die die translationale Frameshifting regulieren. Zwischen objektiv und Kondensator ermöglicht eine Durchflusszelle mit fünf Kanälen eine kontinuierliche Probenapplikation mit laminarer Strömung. Durch die mikrofluidischen Kanäle können verschiedene Komponenten direkt injiziert werden, was die Hands-on-Zeit verkürzt und während des gesamten Experiments einen sehr geringen Probenverbrauch ermöglicht.
Zunächst wird eine grundlegende Richtlinie zur Unterstützung des Designs von OT-Experimenten vorgeschlagen und Vorteile sowie Fallstricke verschiedener Setups diskutiert. Als nächstes werden die Aufbereitung von Proben und experimentelle Workflows beschrieben und ein Protokoll für die Datenanalyse bereitgestellt. Um ein Beispiel darzustellen, skizzieren wir die Ergebnisse von RNA-Dehnungsexperimenten zur Untersuchung des SARS-CoV-2 frameshifting RNA-Elements (Abbildung 2A) mit dem trans-agierenden Faktor, der kurzen Isoform des antiviralen Zinkfingerproteins (ZAP), das die Translation der viralen RNA aus einem alternativen Leserahmen verändert43. Darüber hinaus wird gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte Ribosomen in diesem OT-konfokalen Assay verwendet werden können, was nützlich wäre, um die Prozessivität und Geschwindigkeit der Translationsmaschinerie zu überwachen. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Puffer, Liganden oder anderer zellulärer Komponenten schnell zu testen, um verschiedene Aspekte der Translation zu untersuchen. Schließlich werden häufige experimentelle Fallstricke und deren Behebung diskutiert. Im Folgenden werden einige entscheidende Punkte im experimentellen Design skizziert.
Konstruktionsdesign
Prinzipiell gibt es zwei gängige Ansätze, um ein OT-kompatibles RNA-Konstrukt zu erstellen. Der erste Ansatz verwendet ein langes RNA-Molekül, das mit komplementären DNA-Handles hybridisiert wird, wodurch ein Konstrukt aus zwei RNA/DNA-Hybridregionen entsteht, die eine einzelsträngige RNA-Sequenz in der Mitte flankieren (Abbildung 2B). Dieser Ansatz wird in den meisten OT-RNA-Experimenten verwendet33,44,45.
Der zweite Ansatz nutzt dsDNA-Griffe mit kurzen (ca. 20 nt) Überhängen15,17. Diese Überhänge werden dann mit dem RNA-Molekül hybridisiert. Obwohl komplizierter im Design, überwindet die Verwendung von dsDNA-Handles einige Einschränkungen des DNA / RNA-Hybridsystems. Prinzipiell können auch sehr lange Griffe (>10kb) realisiert werden, was für konfokale Messungen komfortabler ist. Darüber hinaus kann das RNA-Molekül an DNA-Handles ligiert werden, um die Tether-Stabilität zu erhöhen.
End-Labeling-Strategie
Das Konstrukt muss über eine starke molekulare Wechselwirkung an Perlen gebunden werden. Während es Ansätze für die kovalente Bindung von Griffen an Perlen46 gibt, werden starke, aber nicht-kovalente Wechselwirkungen wie Streptavidin-Biotin und Digoxigenin-Antikörper häufig in OT-Experimenten verwendet15,33,35,45. Im beschriebenen Protokoll wird das Konstrukt mit Biotin oder Digoxigenin markiert, und die Kügelchen sind mit Streptavidin bzw. Antikörpern gegen Digoxigenin beschichtet (Abbildung 1A). Dieser Ansatz wäre für die Anwendung von Kräften bis zu etwa 60 pN (per Tether)47 geeignet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung unterschiedlicher 5′- und 3′-Markierungsstrategien die Bestimmung der Ausrichtung des zwischen den Kügelchen gebildeten Seils17.
Proteinmarkierung für Fluoreszenzmessungen
Für die konfokale Bildgebung gibt es mehrere häufig verwendete Ansätze zur Fluoreszenzmarkierung. Zum Beispiel können Fluorophore kovalent an Aminosäurereste gebunden sein, die nativ in Proteinen vorkommen oder durch ortsgerichtete Mutagenese durch eine reaktive organische Gruppe eingeführt werden. Thiol- oder Amin-reaktive Farbstoffe können zur Markierung von Cystein- bzw. Lysinresten verwendet werden. Es gibt mehrere reversible Schutzmethoden, um die Spezifität der Markierung zu erhöhen48,49, jedoch würden native Proteine typischerweise an mehreren Rückständen markiert. Obwohl die geringe Größe des Fluorophors einen Vorteil bieten kann, kann eine unspezifische Markierung die Proteinaktivität beeinträchtigen und somit die Signalintensität variieren49. Abhängig von der Markierungseffizienz kann die Signalintensität zwischen verschiedenen Experimenten variieren. Daher sollte vor dem Experiment eine Aktivitätsprüfung durchgeführt werden.
Falls das Protein von Interesse ein N- oder C-terminales Tag enthält, wie z. B. ein His-Tag oder ein Streptokokken-Tag, stellt die spezifische Kennzeichnung dieser Tags einen weiteren beliebten Ansatz dar. Darüber hinaus verringert die markierungsorientierte Markierung die Wahrscheinlichkeit, dass das Fluorophor die Proteinaktivität stört, und kann die Löslichkeit verbessern49. Die Tag-spezifische Markierung führt jedoch in der Regel zu monofluorophor markierten Proteinen, die schwer nachzuweisen sein können. Eine andere Möglichkeit der spezifischen Markierung kann durch den Einsatz von Antikörpern erreicht werden.
Aufbau der Mikrofluidik
Die Kombination von OT mit einem Mikrofluidik-System ermöglicht einen schnellen Übergang zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. Darüber hinaus nutzen Stromsysteme die Aufrechterhaltung der laminaren Strömung in der Durchflusszelle, was das Mischen von Flüssigkeiten aus anderen Kanälen in senkrechter Richtung relativ zur Strömungsrichtung verhindert. Daher ist die laminare Strömung besonders vorteilhaft für das experimentelle Design. Derzeit werden häufig Flusszellen mit bis zu 5 Kanälen eingesetzt (Abbildung 3).
Hier demonstrieren wir die Verwendung von fluoreszenzgekoppelten optischen Pinzetten, um Wechselwirkungen und dynamisches Verhalten von RNA-Molekülen mit verschiedenen Liganden zu untersuchen. Im Folgenden werden kritische Schritte und Einschränkungen der vorliegenden Technik diskutiert.
Kritische Schritte im Protokoll
Wie bei vielen anderen Methoden ist die Qualität der Probe entscheidend, um zuverlässige Daten zu erhalten. Um Proben von höchstmöglicher Qualität zu …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Anuja Kibe und Jun. Prof. Redmond Smyth für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Wir danken Tatyana Koch für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Kristyna Pekarkova für die Hilfe bei der Aufnahme experimenteller Videos. Die Arbeit in unserem Labor wird von der Helmholtz-Gemeinschaft unterstützt und vom Europäischen Forschungsrat (ERC) Grant Nr. 948636 (bis NC) gefördert.
Bacterial Strains | |||
E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
Chemicals and enzymes | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
Kits | |||
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
Oligonucleotides | |||
5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
DNA vectors | |||
pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
Software and Algorithms | |||
Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
Bluelake | Lumicks | N/A | |
Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
Outro | |||
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
Devices | |||
C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |