Farelerde Stresi Azaltmak için Elleçleme Teknikleri
Summary
Bu makalede, farelerde anksiyete benzeri davranışları azaltarak rutin elleçlemeyi kolaylaştıran ve mevcut iki ilgili teknikle (tünel ve kuyruk elleçleme) ayrıntıları sunan 3D işleme tekniği açıklanmaktadır.
Abstract
Laboratuvar hayvanları bilim adamları veya hayvan bakım sağlayıcıları tarafından birden fazla manipülasyona maruz kalır. Bunun neden olduğu stres hayvan refahı üzerinde derin etkilere sahip olabilir ve ayrıca anksiyete önlemleri gibi deneysel değişkenler için şaşırtıcı bir faktör olabilir. Yıllar geçtikten sonra, elleçleme ile ilgili stresi en aza indiren elleçleme teknikleri, farelere özel bir odaklanma ve farelere çok az dikkat ile geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farelerin işleme teknikleri kullanılarak manipülasyonlara alışabileceği gösterilmiştir. Fareleri elleçlemeyi alışkanlık haline getirmek stresi azaltır, rutin kullanımı kolaylaştırır, hayvan refahını artırır, veri değişkenliğini azaltır ve deneysel güvenilirliği artırır. Kullanımın yararlı etkilerine rağmen, özellikle stresli olan kuyruk toplama yaklaşımı hala yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, insan etkileşimi sırasında hayvanın yaşadığı stresi en aza indirmeyi amaçlayan yeni geliştirilen bir fare işleme tekniğinin ayrıntılı bir açıklamasını ve gösterimini sunmaktadır. Bu manuel teknik 3 gün boyunca gerçekleştirilir (3D işleme tekniği) ve hayvanın deneyciye alışkanlık yapma kapasitesine odaklanır. Bu çalışma ayrıca daha önce kurulmuş tünel işleme tekniklerinin (polikarbonat tünel kullanarak) ve kuyruk toplama tekniğinin etkisini göstermektedir. Özellikle incelenenler, davranışsal testler (Elevated-Plus Maze ve Novelty Suppressed Feeding), deneycilerle gönüllü etkileşim ve fizyolojik ölçüm (kortikosteron seviyeleri) kullanarak anksiyete benzeri davranışlar üzerindeki etkileridir. 3D işleme tekniği ve tünel işleme tekniği anksiyete benzeri fenotipleri azalttı. İlk deneyde, 6 aylık erkek fareler kullanılarak, 3D işleme tekniği deneyci etkileşimini önemli ölçüde geliştirdi. İkinci deneyde, 2,5 aylık dişi kullanarak kortikosteron seviyelerini azalttı. Bu nedenle, 3D işleme, deneyciyle etkileşimin gerekli olduğu veya tercih edildiği veya deneme sırasında tünel işlemenin mümkün olmayabileceği senaryolarda yararlı bir yaklaşımdır.
Introduction
Fareler ve sıçanlar preklinik çalışmalar için temel varlıklardır1,2 endokrinal, fizyolojik, farmakolojik veya davranışsal çalışmalar dahil olmak üzere birden fazla amaç için2. Hayvanlarla ilgili artan sayıda çalışmadan, insan etkileşimi de dahil olmak üzere kontrolsüz çevresel değişkenlerin biyomedikal araştırma3, 4,5’teçeşitli sonuçları etkilediği ortaya çıktı. Bu, deneyler ve araştırma laboratuvarları4,5, hayvan araştırmalarında büyük bir uyarı oluşturan önemli değişkenliklerden sorumludur.
Çevresel stresörlerin etkisini sınırlamak ve reaktiviteyi insan etkileşimine indirgemek amacıyla çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Örneğin, çevresel stresörlerin etkisini sınırlamak için laboratuvarlarda konut koşullarının standardizasyonu ve otomatik konut sistemleri6,7 uygulanmıştır. İnsanlarla etkileşimle ilgili olarak, hayvanları işlemek ve taşımak için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar, hayvan rahatsızlığı ve stresine çok az saygı duyardı. Örneğin, hayvanları kuyruklarından almak veya forseps8 kullanmak temel kaygıyı arttırır9,10,11, keşif 9,12’yi azaltır ve çalışmalar içinde ve genelinde bireyler arası değişkenliğe büyük katkıda bulunur13,14. Sonuç olarak, fareler ve sıçanlar için geçerli olan bardak elleçleme tekniği gibi başka yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu yaklaşımda, hayvanlar kafeslerinden “fincanlanır” ve deneyciler tarafından elleri bir fincan oluşturan9, 10,11. Kuyruk işlemeye bir başka yararlı alternatif, fareleri aktarmak için bir polikarbonat tünelin kullanılmasını içerir9,10,15. Bu yaklaşım, fare ve deneyci arasındaki doğrudan etkileşimi ortadan kaldırır. Hem fincan hem de tünel yaklaşımları, kuyruk alma / kuyruk taşıma9,10gibi aversive elleçleme teknikleri ile abartılabilecek anksiyete benzeri davranışları ve deneycinin korkusunu azaltmada etkinlik gösterdi.
Bu nedenle, artan kanıtlar, bireyler arasındaki değişkenliği azaltmak için uygun fare kullanımı9,11ve hayvan refahını artırmak için yararlı olduğunu göstermektedir10. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen teknikler hala sınırlamalarla karşı karşıyadır. Fincan elleçleme tekniği, tesis personeli ve deneyciler için önemli bir zaman dilimi olan 10 gün (2 hafta16’da10 seans)ile 15 hafta 17arasında değişen programlarla uygulanmıştır. Ek olarak, fincan elleçlemenin etkinliği, açık ellerde zorlanma9 ve geleneksel fincan kullanımına göre değişir, naif farelere veya özellikle gergin suşların elden atlasına neden olabilir9,18. Tünel işleme, daha tutarlı ve genellikle daha hızlı sonuçlarla sonuçlanır ve19’uhafife alıp verdirür. Tüneller ev kafesi zenginleştirme olarak da kullanılır. Hayvanların hızlı bir şekilde idare etmelerine yardımcı olmak ve zenginleştirmenin ek faydalarını sağlamak. Bununla birlikte, tünel işleme, hayvanları aparatlar arasında aktarırken sınırlamalara sahiptir. İlginçtir ki, Hurst ve West9ve Henderson ve ark.20, hayvanları tünelden aparatlara aktarmak için nazik ve kısa manuel elle elleçleme kullanmanın fenotiplerini etkilemediğini gösterdi.
Mevcut yöntemlere bir alternatif sağlamak için, kısa bir süre içinde ulaşılabilir alışkanlıkla, bu makalede fincan işleme tekniğini genişleten ve bu nedenle belirli bir ekipman gerektirmeyen yeni bir teknik açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, farelerin elleçleme işlemiyle sahip olduğu konfor seviyesini ölçmek için kilometre taşlarını kullanır. Fare reaktivitesini ve stresini azaltmada (davranışsal ve hormonal seviyelerde) etkinliği gösterir, rutin kullanımı kolaylaştırır ve hayvanlar arasındaki değişkenliği azaltmaya katkıda bulunur. Bu tekniğin ayrıntıları burada verilmiştir ve anksiyete benzeri davranışları azaltma, deneycilerle etkileşimi geliştirme ve periferik stres hormonu (kortikosteron) salınımını sınırlamadaki etkinliği, tünel işleme (pozitif kontrol) ve kuyruk elleçleme teknikleri (negatif kontrol) ile karşılaştırıldığında iki ayrı çalışmada gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma ve yöntem geliştirme, farelerde elleçleme tekniklerinin bilim topluluğu tarafından hala göz ardı edildiği ve bazı laboratuvarların deneylerden önce hayvanlarının stresini ve reaktivitesini azaltmak için alışkanlık veya kullanım tekniklerini uygulamakta hala isteksiz olduğu gözlemine dayanmaktadır. Bir zaman taahhüdünü temsil ederken, hayvan kullanımı hayvanlara yapılacak deneylerin başarısına katkıda bulunabilecek faydalı etkiler sağlar ve veri değişkenliği veya hayvan a?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, camh hayvan bakım komitesine bu çalışmayı desteklenerek teşekkür ederek, prosedürün yararlılığı hakkında kapsamlı geri bildirimde bulunan CAMH hayvan bakıcılarına, açıklanan deneylerin yürütülmesini motive eden ve diğer kullanıcılar için ayrıntılı protokolün sunulmasını sağlayan camh hayvan bakıcılarına teşekkür ediyor. Bu çalışma kısmen CAMH BreakThrough Challenge tarafından finanse edildi, TP’ye verildi ve CAMH’ın iç fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
Referências
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
- Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
- Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
- Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
- Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
- Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
- Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
- Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
- Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
- Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
- LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
- Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures – a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
- Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
- Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can’t we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
- Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).
