Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi
Summary
Questo documento descrive una tecnica di manipolazione nei topi, la tecnica di manipolazione 3D, che facilita la manipolazione di routine riducendo i comportamenti simili all’ansia e presenta dettagli su due tecniche correlate esistenti (gestione del tunnel e della coda).
Abstract
Gli animali da laboratorio sono sottoposti a molteplici manipolazioni da parte di scienziati o fornitori di assistenza agli animali. Lo stress che questo provoca può avere effetti profondi sul benessere degli animali e può anche essere un fattore confondente per variabili sperimentali come le misure di ansia. Nel corso degli anni, sono state sviluppate tecniche di manipolazione che riducono al minimo lo stress correlato alla manipolazione con particolare attenzione ai ratti e poca attenzione ai topi. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi possono essere bituati a manipolazioni utilizzando tecniche di manipolazione. Abituare i topi alla manipolazione riduce lo stress, facilita la manipolazione di routine, migliora il benessere degli animali, diminuisce la variabilità dei dati e migliora l’affidabilità sperimentale. Nonostante gli effetti benefici della manipolazione, l’approccio tail-pick up, che è particolarmente stressante, è ancora ampiamente utilizzato. Questo documento fornisce una descrizione dettagliata e la dimostrazione di una tecnica di manipolazione del topo di nuova concezione intesa a ridurre al minimo lo stress sperimentato dall’animale durante l’interazione umana. Questa tecnica manuale viene eseguita nell’arco di 3 giorni (tecnica di manipolazione 3D) e si concentra sulla capacità dell’animale di abituarsi allo sperimentatore. Questo studio mostra anche l’effetto delle tecniche di gestione del tunnel precedentemente stabilite (utilizzando un tunnel in policarbonato) e la tecnica di raccolta della coda. Specificamente studiati sono i loro effetti sui comportamenti ansiosi, utilizzando test comportamentali (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interazione volontaria con gli sperimentatori e misurazione fisiologica (livelli di corticosterone). La tecnica di gestione 3D e la tecnica di gestione del tunnel hanno ridotto i fenotipi simili all’ansia. Nel primo esperimento, utilizzando topi maschi di 6 mesi, la tecnica di gestione 3D ha migliorato significativamente l’interazione dello sperimentatore. Nel secondo esperimento, utilizzando una femmina di 2,5 mesi, ha ridotto i livelli di corticosterone. Pertanto, la gestione 3D è un approccio utile in scenari in cui l’interazione con lo sperimentatore è richiesta o preferita, o in cui la gestione del tunnel potrebbe non essere possibile durante l’esperimento.
Introduction
Topi e ratti sono risorse essenziali per gli studi preclinici1,2 per molteplici scopi, tra cui studi endocrini, fisiologici, farmacologici o comportamentali2. Dal crescente numero di studi che coinvolgono animali, è emerso che variabili ambientali incontrollate tra cui l’interazione umana influenzano vari risultati nella ricerca biomedica3,4,5. Ciò è responsabile della significativa variabilità osservata tra esperimenti e laboratori di ricerca4,5, ponendo un avvertimento importante nella ricerca sugli animali.
Sono stati implementati vari approcci con l’obiettivo di limitare l’impatto dei fattori di stress ambientale e ridurre la reattività all’interazione umana. Ad esempio, per limitare l’impatto dei fattori di stress ambientale, la standardizzazione delle condizioni abitative e i sistemi abitativi automatizzati6,7 sono stati implementati in tutti i laboratori. Per quanto riguarda l’interazione con gli esseri umani, gli approcci comunemente usati per la manipolazione e il trasporto degli animali avevano poco riguardo per il disagio e lo stress degli animali. Ad esempio, raccogliere gli animali per la coda o usare la pinna8 aumenta l’ansia basale9,10,11,riduce l’esplorazione9,12 e contribuisce notevolmente alla variabilità interimpiale all’interno e tra gli studi13,14. Di conseguenza, sono stati sviluppati altri approcci, come la tecnica di gestione della tazza, che è applicabile a topi e ratti. In questo approccio, gli animali vengono “coppettati” fuori dalla loro gabbia e tenuti dagli sperimentatori con le mani che formano una tazza9,10,11. Un’altra utile alternativa alla movimentazione della coda prevede l’utilizzo di un tunnel in policarbonato per trasferire i topi9,10,15. Questo approccio elimina l’interazione diretta tra il mouse e lo sperimentatore. Sia l’approccio a coppa che a tunnel hanno mostrato efficacia nel ridurre i comportamenti ansiosi e la paura dello sperimentatore che possono essere esagerati da tecniche di manipolazione avverse, come il pick up / tail handling9,10.
Pertanto, prove crescenti dimostrano l’utilità di una corretta manipolazione del topo per ridurre la variabilità tra gli individui9,11e migliorare il benessere degli animali10. Tuttavia, le tecniche sopra menzionate devono ancora affrontare limitazioni. La tecnica di gestione della tazza è stata implementata con programmi che vanno da 10 giorni (10 sessioni in 2 settimane16)fino a 15 settimane17,che è una notevole quantità di tempo per il personale della struttura e gli sperimentatori. Inoltre, l’efficacia della manipolazione della tazza varia in base al ceppo9 e la manipolazione convenzionale della tazza in mani aperte può portare a topi ingenui o ceppi particolarmente saltellanti a saltare dalla mano9,18. La movimentazione delle gallerie si traduce in risultati più coerenti e generalmente più rapidi nella manipolazione19. I tunnel sono anche usati come arricchimento della gabbia domestica. Aiutano gli animali ad abituarsi a maneggiare rapidamente e forniscono i benefici aggiuntivi dell’arricchimento. La gestione delle gallerie, tuttavia, presenta limitazioni nel trasferimento di animali tra apparati. È interessante notare che Hurst e West9e Henderson et al.20 hanno dimostrato che l’uso di una manipolazione manuale delicata e breve per trasferire gli animali dal tunnel all’apparato non influisce sul loro fenotipo.
Per fornire un’alternativa ai metodi esistenti, con un’assuefazione realizzabile in un breve periodo di tempo, questo articolo descrive una nuova tecnica che espande la tecnica di movimentazione della tazza, quindi non richiede particolari attrezzature. Questo approccio utilizza pietre miliari per valutare il livello di comfort che i topi hanno con il processo di manipolazione. Mostra efficacia nel ridurre la reattività e lo stress del topo (a livello comportamentale e ormonale), facilita la manipolazione di routine e contribuisce a ridurre la variabilità tra gli animali. I dettagli di questa tecnica sono forniti qui e la sua efficacia nel ridurre i comportamenti simili all’ansia, migliorare l’interazione con gli sperimentatori e limitare il rilascio dell’ormone dello stress periferico (corticosterone) sono dimostrati in due studi separati (topi maschi e femmine), rispetto alla gestione del tunnel (controllo positivo) e alle tecniche di manipolazione della coda (controllo negativo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio e lo sviluppo del metodo si basano sull’osservazione che le tecniche di manipolazione nei topi sono ancora trascurate dalla comunità scientifica e che alcuni laboratori sono ancora riluttanti a implementare tecniche di assuefazione o manipolazione per ridurre lo stress e la reattività dei loro animali prima degli esperimenti. Pur rappresentando un impegno di tempo, la manipolazione degli animali fornisce effetti benefici agli animali che possono contribuire al successo degli esperimenti da eseguire e impe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Comitato per la cura degli animali di CAMH per aver supportato questo lavoro, così come gli animali caregiver di CAMH che hanno fornito un ampio feedback sull’utilità della procedura, motivando l’esecuzione degli esperimenti descritti e la presentazione del protocollo dettagliato per altri utenti. Questo lavoro è stato in parte finanziato da CAMH BreakThrough Challenge, assegnato a TP, e da fondi interni di CAMH.
Materials
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
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