본 연구는 마이크로어레이 기술로 얻은 DNA 메틸화 데이터를 관리하기 위한 워크플로우를 기술한다. 이 프로토콜은 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 단계를 보여 줍니다. 모든 절차가 자세히 설명되어 있으며 비디오에서는 중요한 단계를 보여줍니다.
비만은 생활 양식과 직접 관련이 있으며 질병의 발달에 기여하는 지방 생성 및 지질 저장 과정의 변화를 일으킬 수있는 DNA 메틸화 변화와 관련이 있습니다. 우리는 선택에서 비만 유무에 관계없이 환자의 후성 유전 학적 데이터 분석에 이르기까지 완벽한 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜의 모든 단계는 파일럿 연구에서 테스트되고 검증되었습니다. 32 명의 여성이 연구에 참여했으며, 15 명의 개인이 체질량 지수 (BMI) (45.1 ± 5.4 kg / m2)에 따라 비만으로 분류되었습니다. 17 개인은 BMI (22.6 ± 1.8 kg / m2)에 따라 비만없이 분류되었습니다. 비만이 있는 그룹에서, 지방량과 관련된 564개의 CpG 부위가 선형 회귀 분석에 의해 확인되었다. CpG 부위는 프로모터 영역에 있었다. 차등 분석은 비만 환자에서 470 CpGs 하이포 메틸화 및 94 하이퍼 메틸화 부위를 발견했습니다. 가장 저메틸화 된 농축 경로는 RUNX, WNT 신호 전달 및 저산소증에 대한 반응이었습니다. 하이퍼메틸화 경로는 인슐린 분비, 글루카곤 신호전달, 및 Ca2+와 관련되었다. 우리는 프로토콜이 DNA 메틸화 패턴과 형질 관련 DNA 메틸화를 효과적으로 확인했다고 결론지었다. 이러한 패턴은 변경된 유전자 발현과 관련이있을 수 있으며, 지방 생성 및 지질 저장에 영향을 줄 수 있습니다. 우리의 결과는 비만 성 생활 방식이 인간 DNA의 후성 유전 적 변화를 촉진 할 수 있음을 확인했습니다.
대규모 오믹스 기술은 만성 질환 연구에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이러한 방법의 흥미로운 특징은 많은 양의 생성 된 데이터를 과학계에 제공한다는 것입니다. 따라서 연구 간의 기술적 비교를 허용하기 위해 프로토콜을 표준화하려는 요구가 제기되었습니다. 본 연구는 파일럿 연구를 적용 사례로 사용하여 DNA 메틸화 데이터를 획득하고 분석하기위한 프로토콜의 표준화를 제안합니다.
부정적인 에너지 소비는 현대 인간의 생활 방식에서 우세하며, 지방 조직의 과도한 축적과 결과적으로 비만의 발달로 이어집니다. 많은 요인들이 좌식증, 고칼로리 다이어트 및 스트레스가 많은 일상과 같은 비만율을 증가 시켰습니다. 세계 보건기구 (WHO)는 2016 년에 1.9 억 명의 성인이 비만이라고 추정했는데, 이는 세계 인구의 20 % 이상이 30kg / m2 이상의 BMI2를 가지고 있음을 의미합니다. 2018의 가장 최근의 업데이트에 따르면 미국 (미국)에서 비만의 유병률이 42 % 3보다 높았다.
후성유전학은 변화된 활동 상태를 등록, 신호 또는 영속화하기 위해 염색체 영역의 구조적 적응이다4. DNA 메틸화는 시토신-구아노신 디뉴클레오타이드 부위(CpG 부위)에서 가역적인 화학적 변화로, 5-메틸시토신-pG(5mCpG)를 형성한다. DNA5,6,7,8에 대한 전사 기계의 접근을 조절함으로써 유전자 발현을 조절할 수 있다. 이러한 맥락에서, 어떤 CpG 부위가 비만 관련 특성과 연관되어 있는지 이해하는 것이 필수적이다9. 많은 인자가 부위-특이적 DNA 메틸화를 지지하거나 예방할 수 있다. DNA 메틸트랜스퍼라제10(DNTMs) 및 10-10-17 전좌(TETs)와 같은 이 과정에 필요한 효소는 환경 노출하에서 DNA 메틸화 또는 탈메틸화를 촉진할 수 있다11.
지난 몇 년 동안 DNA 메틸화 연구에 대한 관심이 높아짐에 따라 각 질문에 정확하게 대답 할 수있는 가장 적절한 분석 전략을 선택하는 것이 연구자의 필수 관심사였습니다.12,13,14. 450K DNA 메틸화 어레이는 DNA 메틸화 프로파일을 결정하기 위해 360개 이상의 간행물14에서 사용되는 가장 널리 사용되는 방법입니다. 알려진 유전자의 99%에 위치한 최대 485,000 CpGs의 메틸화를 결정할 수 있다15. 그러나 이 어레이는 중단되고 EPIC로 대체되어 850,000개의 CpG 사이트를 커버합니다. 본 프로토콜은 450K 및 EPIC16,17,18 모두에 적용될 수 있다.
이 프로토콜은 도 1 에서 단계별로 제시되며 집단 선택, 샘플링, 실험 준비, DNA 메틸화 파이프라인 및 생물정보학 분석과 같은 단계로 구성됩니다. 우리 실험실에서 수행 된 파일럿 연구는 제안 된 프로토콜의 단계를 설명하기 위해 여기에서 시연됩니다.
그림 1: 제시된 프로토콜의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
DNA 메틸화 어레이는 비용 편익 비율14로 인해 DNA 메틸화에 접근하는 데 가장 많이 사용되는 방법입니다. 본 연구는 브라질 코호트에서 수행된 파일럿 연구에서 DNA 메틸화를 평가하기 위해 상업적으로 이용가능한 마이크로어레이 플랫폼을 사용하는 상세한 프로토콜을 기술하였다. 파일럿 연구에서 얻은 결과는 프로토콜의 효과를 확인했습니다. 도 3은 샘플 비교성 및 완전한 중아황산염 전환(bisulfite conversion32)을 도시한다.
품질 관리 단계로서 ChAMP 알고리즘은 필터링 프로세스 중에 CpGs 사이트를 제외하는 것이 좋습니다. 프로브를 제외하는 목적은 데이터 분석을 개선하고 편향을 제거하는 것입니다. 낮은 품질의 CpGs(0.05보다 낮은 p-값)를 제거하여 데이터 세트에서 실험 잡음을 제거했습니다. 목표는 밀도 플롯 분석에서 통과 된 채로 남아 있습니다. Zhou33은 불일치를 피하기 위해 SNP 근처에서 CpG를 필터링하는 것의 중요성, 다형성 시토신의 메틸화의 오해, 유형 I 프로브 설계의 스위치 색상 유발34의 중요성을 설명했습니다. 또한 XY 염색체가 각인에 의해 차별적으로 영향을 받기 때문에 Heiss와 Just35 는 여성에서 교잡 문제가 혼란스러운 요인이 될 수 있기 때문에 이러한 프로브를 필터링하는 것의 중요성을 강화했습니다35.
DMAPs 만료일, 포름아미드 개방일, 절대 에탄올의 분석 품질 및 총 백혈구 수는 프로토콜에서 중요한 단계로 간주됩니다.
또한, 우리의 관찰에 따르면, 세포 유형 추정은 생물 정보학 분석을 수행하는 데 필수적입니다. Houseman 방법은 Tian의 연구30에 설명 된대로 세포 유형 추정을 수행합니다. 이 방법은 과립구, 단핵구, B 세포 및 T 세포와 같은 가장 중요한 세포 유형의 백분율을 예측할 수 있는 473개의 특정 CpG 부위에 기초한다36. 우리는 ChAMP 패키지에서 권장되는 기능 “myRefbase”를 사용했습니다. 추정 후 ChAMP 알고리즘은 베타 값을 조정하고 데이터 세트에서 이러한 편향을 제거합니다. 이 단계는 비만에 초점을 맞춘 연구에서 매우 중요한데, 그 이유는 이 집단이 만성 염증 상태로 인해 백혈구에 상당한 차이가 있기 때문이다.
메서드 수정 및 문제 해결과 관련된 일반적인 PCR 씰에 대한 원래 캡 맵만 변경했습니다. 각각의 원심분리 과정 후에, 밀봉은 새로운 것에 대해 변경되었다. 우리는 표준 열 밀봉을 사용할 수 없었고 플레이트 주위에 알루미늄 호일을 사용하여 적응했습니다.
상업적 분석이 후성유전학 연구의 황금 표준으로 간주되었지만, 프로토콜의 한 가지 한계는 독특한 브랜드37,38,39,40의 시약 및 장비의 특이성일 수 있다. 또 다른 한계는 실험41의 정확한 진행을 식별할 수 있는 지표의 부족이다.
본 프로토콜의 표준화는 후성 유전학 연구를위한 훌륭한 지침이며, 프로세스 중 인적 오류를 줄이고 성공적인 데이터 분석 및 다른 연구 간의 비교 가능성을 허용합니다.
우리의 결과에 따르면, DNA 메틸화 실험은 비만이 있거나없는 개인을 비교하는 연구에 적합합니다43. 또한 제안 된 생물 정보학 분석은 고품질의 데이터를 제공했으며 대규모 연구에서 고려 될 수있었습니다.
SVD 분석을 사용하여, 우리는 비만 관련 형질 (BMI, WC 및 FM)이 DNA 메틸화 데이터의 변동성에 영향을 미친다는 것을 확인했다. 유의미한 결과로서, 세포형 추정은 자연살해세포(NK)와 B세포가 모두 비만이 없는 여성보다 비만 여성에서 더 높았음을 나타낸다(도 5). 이들 세포의 더 높은 카운트는 이들 개인들의 낮은 등급의 염증 상태에 의해 설명될 수 있다44. 우리는 비만 환자가 지방 질량과 관련된 유전자의 프로모터 영역에서 hypo- 및 hypermethylated CpGs를 가지고 있음을 관찰했다. 대부분의 부위는 하이포메틸화되었으며, 이는 이들 개체에서 반응성 산소 종 (ROS) 수준의 자연적 증가와 관련이있을 수 있습니다. 이러한 산화적 스트레스 조건은 디뉴클레오타이드 부위에서 구아닌 교란을 촉진하여 8-하이드록시-2′-데옥시구아노신(8-OHdG)을 형성하고, 이로 인해 5mCp-8-OHdG 디뉴클레오타이드 부위를 생성하고, TET 효소 모집을 야기할 수 있다. 이러한 모든 사건은 상이한 작용 메카니즘에 의해 DNA 하이포메틸화 및 하이퍼메틸화를 촉진시키는 역할을 할 수 있다45.
또한, 지방 생성의 비율은 비만 환자에서 증가하는 것으로 보이며, 오래된 세포에 대한 새로운 세포의 약 10 %46,47. 비만 환경을 강조하는 후성 유전 학적 기여는 세포의 증식 및 분화 속도를 변화시켜 지방 질량의 발달을 촉진 할 수 있습니다48. 후성 유전 학적 변화는 또한 아디포겐 프로그램에 영향을 미쳐 발달을 촉진하거나 제한 할 수 있습니다. 일차 전사 인자 (PPARγ 또는 C/EBPα) 또는 후성유전학적 변형 효소를 포함하거나 배제함으로써 조작되는 하류 프로모터 영역에 위치하는 다중 단백질 복합체의 조립은, 하이퍼- 또는 하이포메틸화를 통해 유전자 발현을 조절한다45. PPARγ 경로는 이전에 WNT 경로를 변경하기 위해 기술되었으며, 이는 본 연구에서 유전자가 풍부했다. 지방 생성 중에 WNT 신호 전달이 어떻게 발생하는지는 아직 알려지지 않았지만, 최근의 연구에 따르면 특히 비만 성 조건 하에서 지방 세포 대사에 필수적인 역할을 할 수 있다고보고되었습니다49.
The authors have nothing to disclose.
ChAMP 패키지에 대한 모든 의구심에 답할 수 있게 해주신 Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk)에게 감사드립니다. 우리는 또한이 논문의 기술 및 과학 문제에 대한 그의 공헌에 대해 Guilherme Telles, Msc.에게 감사드립니다. 그는 후성 유전학 및 비디오 캡처 및 서식 기술 (guilherme.telles@usp.br)에 관한 중요한 고려 사항을했습니다. 소모품 기금 : 상파울루 연구 재단 (FAPESP) (#2018/24069-3) 및 국립 과학 기술 개발 협의회 (CNPq : #408292 / 2018-0). 개인 기금 : (FAPESP : # 2014 / 16740-6) 및 고등 교육 직원 개발을위한 조정의 학업 우수 프로그램 (CAPES : 88882.180020 / 2018-01). 데이터는 공개적으로 공개되며 제한없이 자유롭게 사용할 수 있습니다. NYN (이메일 : nataliayumi@usp.br) 또는 CBN (이메일 : carla@fmrp.usp.br)에 대한 주소 서신.
Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
NaOH | F. MAIA | 114700 | |
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |