Den nåværende studien beskriver arbeidsflyten for å håndtere DNA-metyleringsdata innhentet av mikroarrayteknologier. Protokollen viser trinn fra prøveforberedelse til dataanalyse. Alle prosedyrer er beskrevet i detalj, og videoen viser de betydelige trinnene.
Fedme er direkte knyttet til livsstil og har vært forbundet med DNA-metyleringsendringer som kan forårsake endringer i adipogenesen og lipidlagringsprosessene som bidrar til utviklingen av sykdommen. Vi demonstrerer en komplett protokoll fra utvelgelse til epigenetisk dataanalyse av pasienter med og uten fedme. Alle trinnene fra protokollen ble testet og validert i en pilotstudie. 32 kvinner deltok i studien, hvor 15 personer ble klassifisert med fedme i henhold til Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg / m2); og 17 personer ble klassifisert uten fedme i henhold til BMI (22,6 ± 1,8 kg/m2). I gruppen med fedme ble 564 CpG-nettsteder relatert til fettmasse identifisert ved lineær regresjonsanalyse. CpG-nettstedene var i promotorregionene. Differensialanalysen fant 470 cpgs hypometylerte og 94 hypermetylerte steder hos personer med fedme. De mest hypometylerte berikede veiene var i RUNX-, WNT-signalisering og respons på hypoksi. De hypermetylerte banene var relatert til insulinsekresjon, glukagonsignalering og Ca2+. Vi konkluderer med at protokollen effektivt identifiserte DNA-metyleringsmønstre og trekkrelatert DNA-metylering. Disse mønstrene kan være forbundet med endret genuttrykk, som påvirker adipogenese og lipidlagring. Våre resultater bekreftet at en overvektig livsstil kunne fremme epigenetiske endringer i menneskelig DNA.
Store omics teknologier har blitt stadig mer brukt i studier av kroniske sykdommer. Et interessant trekk ved disse metodene er tilgjengeligheten av en stor mengde genererte data til det vitenskapelige samfunnet. Derfor har det oppstått et krav om å standardisere protokollene for å tillate teknisk sammenligning mellom studier. Den nåværende studien antyder standardisering av en protokoll for å innhente og analysere DNA-metyleringsdata, ved hjelp av en pilotstudie som et applikert eksempel.
Negative energiforbruk dominerer i moderne menneskelig livsstil, noe som fører til overdreven akkumulering av fettvev og følgelig utviklingen av fedme¹. Mange faktorer har økt fedme priser, som sedentarisme, høyt kalori dietter, og stressende rutiner. Verdens helseorganisasjon (WHO) anslo at 1,9 milliarder voksne var overvektige i 2016, noe som betyr at mer enn 20% av verdens befolkning har over 30 kg / m2 BMI2. Den siste oppdateringen av 2018 viste at forekomsten av fedme i USA var høyere enn 42%3.
Epigenetikk er den strukturelle tilpasningen av kromosomale regioner for å registrere, signalisere eller opprettholde endrede aktivitetstilstander4. DNA-metylering er en reversibel kjemisk endring i cytosin-guanosin dinukleotider (CpG-steder), som danner 5-metylcytosin-pG (5mCpG). Det kan modulere genuttrykk ved å regulere tilgangen til transkripsjonsmaskineriet til DNA5,6,7,8. I denne sammenhengen er det viktig å forstå hvilke CpG-nettsteder som er forbundet med fedmerelaterte egenskaper9. Mange faktorer kan støtte eller forhindre stedsspesifikk DNA-metylering. Nødvendige enzymer for denne prosessen, som DNA-metyltransferaser10 (DNTMer) og ti-elleve translokasjoner (TETer), kan fremme DNA-metylering eller demetylering under miljøeksponeringer11.
Tatt i betraktning den økende interessen for DNA-metyleringsstudier de siste årene, har det å velge den mest hensiktsmessige analysestrategien for å svare nøyaktig på hvert spørsmål vært en viktig bekymring for forskere12,13,14. 450K DNA-metyleringsmatrisen er den mest populære metoden, brukt i mer enn 360 publikasjoner14 for å bestemme DNA-metyleringsprofilen. Det kan bestemme metylering av opptil 485 000 cpgs lokalisert i 99% av kjente gener15. Imidlertid har denne matrisen blitt avviklet og erstattet med EPIC, som dekker 850 000 CpG-nettsteder. Den nåværende protokollen kan brukes for både 450K og EPIC16,17,18.
Protokollen presenteres trinn for trinn i figur 1 og består av følgende trinn: populasjonsvalg, prøvetaking, eksperimentforberedelse, DNA-metyleringsrørledning og bioinformatikkanalyse. En pilotstudie utført i vårt laboratorium er demonstrert her for å illustrere trinnene i den foreslåtte protokollen.
Figur 1: Skjematisk for den presenterte protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
DNA-metyleringskjeder er de mest brukte metodene for å få tilgang til DNA-metylering på grunn av deres nytte-kostnadsforhold14. Den nåværende studien beskrev en detaljert protokoll ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig mikroarrayplattform for å evaluere DNA-metylering i en pilotstudie utført i en brasiliansk kohort. De oppnådde resultatene fra pilotstudien bekreftet effektiviteten av protokollen. Figur 3 viser utvalgskomparabiliteten og den fullstendige bisulfittkonverteringen32.
Som et kvalitetskontrolltrinn anbefalte ChAMP-algoritmen utelukkelse av CpGs-nettsteder under filtreringsprosessen. Målet med å ekskludere sonder er å forbedre dataanalysen og eliminere skjevheter. Cpgs av lav kvalitet (p-verdier lavere enn 0,05) ble fjernet for å eliminere eksperimentell støy i datasettet. Målene forble passert i tetthetsplottanalysen. Zhou33 beskrev viktigheten av å filtrere CPG-er i nærheten av SNPer for å unngå uoverensstemmelser, feiltolkning av polymorfiske cytosiners metylering og forårsake bryterfarge av type I-sondedesign34. Også, som XY kromosomer er differensialt påvirket av avtrykk, Heiss og Just35 forsterket viktigheten av å filtrere disse sondene fordi, hos kvinner, problemene med hybridisering kan være forvirrende faktorer35.
DMAPs utløpsdato, formamid-åpningsdatoen, den analytiske kvaliteten på det absolutte etanolet og totalt antall leukocytt anses som kritiske trinn i protokollen.
Videre, ifølge våre observasjoner, er celletypeestimering avgjørende for å utføre bioinformatikkanalysen. Houseman-metoden utfører celletypeestimering som beskrevet i Tians studie30. Denne metoden er basert på 473 spesifikke CpG-områder som kan forutsi prosentandelen av de viktigste celletypene, for eksempel granulocytter, monocytter, B-celler og T-celler36. Vi brukte den anbefalte funksjonen “myRefbase” fra ChAMP-pakken. Etter beregningen justerer ChAMP-algoritmen betaverdiene og eliminerer denne skjevheten fra datasettet. Dette trinnet er avgjørende i studier fokusert på fedme fordi denne befolkningen har en betydelig forskjell i hvite blodlegemer på grunn av deres kroniske inflammatoriske tilstand.
Vi endret bare det opprinnelige hettekartet for den vanlige PCR-forseglingen angående metodeendring og feilsøking. Etter hver sentrifugeringsprosess ble forseglingen endret for en ny. Vi kunne ikke bruke standard varmeforsegling og tilpasset den ved hjelp av aluminiumsfolie rundt platen.
Selv om kommersielle analyser har blitt ansett som en gullstandard for epigenetiske studier, kan en begrensning av protokollen være spesifisiteten til reagensene og utstyret fra et unikt merke37,38,39,40. En annen begrensning er mangelen på indikatorer som tillater identifisering av riktig fremdrift av eksperimentet41.
Standardiseringen av den nåværende protokollen representerer en flott guide for epigenetisk forskning, redusere menneskelige feil under prosessen og tillate vellykket dataanalyse og sammenlignbarhet mellom ulike studier.
Ifølge våre resultater er DNA-metyleringseksperimenter egnet for studier som sammenligner individer med og uten fedme43. Den foreslåtte bioinformatikkanalysen ga også data av høy kvalitet og kunne vurderes i store studier.
Ved hjelp av SVD-analysen identifiserte vi at fedmerelaterte egenskaper (BMI, WC og FM) påvirket variasjonen i DNA-metyleringsdata. Som et betydelig resultat indikerer celletypeestimeringen at både naturlige morderceller (NK) og B-celler var høyere hos kvinner med fedme enn hos kvinner uten fedme (figur 5). De høyere tellingene av disse cellene kan forklares av den lavverdige inflammatoriske tilstanden til disse individene44. Vi observerte at pasienter med fedme har hypo- og hypermetylerte cpgs i promotorregioner av gener forbundet med fettmasse. De fleste stedene var hypometylerte, noe som kunne være relatert til den naturlige økningen i reaktive oksygenarter (ROS) nivåer hos disse individene. Denne oksidative stresstilstanden kan fremme guaninperturbance på dinukleotidstedet, som danner 8-hydroksy-2′-deoksyguanosin (8-OHdG), noe som resulterer i et 5mCp-8-OHdG dinucleotidsted, og forårsaker rekruttering av TET-enzymer. Alle disse hendelsene kan være ansvarlige for å fremme DNA-hypometylering og hypermetylering ved ulike virkningsmekanismer45.
I tillegg ser adipogenesehastigheten ut til å øke hos personer med fedme, med ca. 10% av nye celler til gamle celler46,47. Epigenetiske bidrag, som understreker det overvektige miljøet, kan endre cellenes spredning og differensieringshastigheter, og favoriserer utviklingen av fettmasse48. Epigenetiske endringer kan også påvirke adipogene programmer, legge til rette for eller begrense utviklingen. Primære transkripsjonsfaktorer (PPARγ eller C / EBPα) eller montering av multiproteinkomplekser, plassert i nedstrøms promotorregioner som drives ved å inkludere eller ekskludere epigenetiske modifiserende enzymer, regulerer genuttrykk gjennom hyper- eller hypometylering45. PPARγ-banen har tidligere blitt beskrevet for å endre WNT-banen, som hadde gener beriket i denne studien. Selv om det fortsatt er ukjent hvordan WNT-signalering skjer under adipogenese, har nyere studier rapportert at det kan ha viktige roller i adipocyttmetabolismen, spesielt under overvektige forhold49.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) for å være tilgjengelig for å svare på all tvil om ChAMP-pakken. Vi takker også Guilherme Telles, Msc. for hans bidrag både til tekniske og vitenskapelige spørsmål fra denne avisen; han tok viktige hensyn til epigenetikk og videoopptak og formateringsteknikker (guilherme.telles@usp.br). Forbruksvarer Finansiering: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) og National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Personlig finansiering: (FAPESP: #2014/16740-6) og Academic Excellence Program fra Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES:88882.180020/2018-01). Dataene vil bli gjort offentlig og fritt tilgjengelig uten begrensning. Adressekorrespondanse til NYN (e-post: nataliayumi@usp.br) eller CBN (e-post: carla@fmrp.usp.br).
Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
NaOH | F. MAIA | 114700 | |
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |