Den föreliggande studien beskriver arbetsflödet för att hantera DNA-metyleringsdata erhållna med mikroarray-teknik. Protokollet visar steg från provberedning till dataanalys. Alla procedurer beskrivs i detalj, och videon visar de viktiga stegen.
Fetma är direkt kopplad till livsstil och har associerats med DNA-metyleringsförändringar som kan orsaka förändringar i adipogenesen och lipidlagringsprocesserna som bidrar till utvecklingen av sjukdomen. Vi demonstrerar ett komplett protokoll från urval till epigenetisk dataanalys av patienter med och utan fetma. Alla steg från protokollet testades och validerades i en pilotstudie. 32 kvinnor deltog i studien, där 15 individer klassificerades med fetma enligt Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg/m2); och 17 individer klassificerades utan fetma enligt BMI (22,6 ± 1,8 kg/m2). I gruppen med fetma identifierades 564 CpG-platser relaterade till fettmassa genom linjär regressionsanalys. CpG-webbplatserna var i promotorregionerna. Differentialanalysen fann 470 CpGs hypometylerade och 94 hypermetylerade platser hos individer med fetma. De mest hypometylerade berikade vägarnavar i RUNX, WNT-signalering och svar på hypoxi. De hypermetylerade vägarna var relaterade till insulinsekretion, glukagonsignalering och Ca2+. Vi drar slutsatsen att protokollet effektivt identifierade DNA-metyleringsmönster och egenskapsrelaterad DNA-metylering. Dessa mönster kan associeras med förändrat genuttryck, vilket påverkar adipogenes och lipidlagring. Våra resultat bekräftade att en obesogen livsstil kan främja epigenetiska förändringar i mänskligt DNA.
Storskalig omikteknik har i allt högre grad använts i studier av kroniska sjukdomar. En intressant egenskap hos dessa metoder är tillgången till en stor mängd genererade data till det vetenskapliga samfundet. Därför har ett krav på att standardisera protokollen uppstått för att möjliggöra teknisk jämförelse mellan studier. Den föreliggande studien föreslår standardisering av ett protokoll för att erhålla och analysera DNA-metyleringsdata, med hjälp av en pilotstudie som ett tillämpligt exempel.
Negativ energiförbrukning dominerar i modern mänsklig livsstil, vilket leder till en överdriven ackumulering av fettvävnad och följaktligen utvecklingen av fetma¹. Många faktorer har ökat fetma, såsom sedentarism, kaloririka dieter och stressiga rutiner. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattade att 1,9 miljarder vuxna var överviktiga 2016, vilket innebär att mer än 20% av världens befolkning har över 30 kg / m2 BMI2. Den senaste uppdateringen från 2018 avslöjade att förekomsten av fetma i USA (USA) var högre än 42%3.
Epigenetik är den strukturella anpassningen av kromosomala regioner för att registrera, signalera eller upprätthålla förändrade aktivitetstillstånd4. DNA-metylering är en reversibel kemisk förändring i cytosin-guanosin-dinukleotiderna (CpG-ställen) och bildar 5-metylcytosin-pG (5mCpG). Det kan modulera genuttryck genom att reglera transkriptionsmaskineriets åtkomst till DNA5,6,7,8. I detta sammanhang är det viktigt att förstå vilka CpG-webbplatser som är associerade med fetma-relaterade egenskaper9. Många faktorer kan stödja eller förhindra platsspecifik DNA-metylering. Nödvändiga enzymer för denna process, såsom DNA-metyltransferaser10 (DNTM) och tio-elva translokationer (TET), kan främja DNA-metylering eller demetylering under miljöexponering11.
Med tanke på det växande intresset för DNA-metyleringsstudier under de senaste åren har valet av den lämpligaste analysstrategin för att exakt svara på varje fråga varit en viktig fråga för forskare12,13,14. 450K DNA-metyleringsmatrisen är den mest populära metoden som används i mer än 360 publikationer14 för att bestämma DNA-metyleringsprofilen. Det kan bestämma metyleringen av upp till 485 000 CpGs som finns i 99% av kända gener15. Denna matris har dock avbrutits och ersatts med EPIC, som täcker 850 000 CpG-webbplatser. Det nuvarande protokollet kan tillämpas för både 450K och EPIC16,17,18.
Protokollet presenteras steg för steg i figur 1 och omfattar följande steg: populationsval, provtagning, experimentberedning, DNA-metyleringspipeline och bioinformatikanalys. En pilotstudie utförd i vårt laboratorium demonstreras här för att illustrera stegen i det föreslagna protokollet.
Figur 1: Schematiskt över det presenterade protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
DNA-metyleringsmatriser är de mest använda metoderna för att få tillgång till DNA-metylering på grund av deras kostnads-nyttoförhållande14. Den föreliggande studien beskrev ett detaljerat protokoll med hjälp av en kommersiellt tillgänglig mikroarrayplattform för att utvärdera DNA-metylering i en pilotstudie utförd i en brasiliansk kohort. De erhållna resultaten från pilotstudien bekräftade protokollets effektivitet. Figur 3 visar provets jämförbarhet och den fullständiga bisulfitomvandlingen32.
Som ett kvalitetskontrollsteg rekommenderade ChAMP-algoritmen uteslutning av CpGs-webbplatser under filtreringsprocessen. Syftet med att utesluta sonder är att förbättra dataanalysen och eliminera bias. CpG:er av låg kvalitet (p-värden lägre än 0,05) togs bort för att eliminera experimentellt brus i datauppsättningen. Målen förblev godkända i densitetsdiagramanalysen. Zhou33 beskrev vikten av att filtrera CpGs nära SNP för att undvika missmatchningar, feltolkning av polymorfa cytosiners metylering och orsaka switchfärg av typ I-sonddesign34. Eftersom XY-kromosomer påverkas differentiellt av imprinting, förstärkte Heiss och Just35 vikten av att filtrera dessa sonder eftersom problemen med hybridisering hos kvinnor kan vara förvirrande faktorer35.
DMAP: s utgångsdatum, formamidens öppningsdatum, den analytiska kvaliteten hos den absoluta etanolen och det totala leukocytantalet anses vara kritiska steg i protokollet.
Enligt våra observationer är dessutom celltypsuppskattningen avgörande för att utföra bioinformatikanalysen. Houseman-metoden utför celltypsuppskattningen som beskrivs i Tians studie30. Denna metod är baserad på 473 specifika CpG-platser som kan förutsäga procentandelarna av de viktigaste celltyperna, såsom granulocyter, monocyter, B-celler och T-celler36. Vi använde den rekommenderade funktionen “myRefbase” från ChAMP-paketet. Efter uppskattningen justerar ChAMP-algoritmen betavärdena och eliminerar denna bias från datauppsättningen. Detta steg är avgörande i studier som fokuserar på fetma eftersom denna befolkning har en betydande skillnad i vita blodkroppar på grund av deras kroniska inflammatoriska tillstånd.
Vi ändrade bara den ursprungliga lockkartan för den vanliga PCR-tätningen angående metodmodifiering och felsökning. Efter varje centrifugeringsprocess byttes tätningen mot en ny. Vi kunde inte använda standard värmetätning och anpassade den med aluminiumfolie runt plattan.
Även om kommersiella analyser har ansetts vara en guldstandard för epigenetiska studier, kan en begränsning av protokollet vara specificiteten hos reagenserna och utrustningen från ett unikt varumärke37,38,39,40. En annan begränsning är bristen på indikatorer som gör det möjligt att identifiera experimentets korrekta framsteg41.
Standardiseringen av detta protokoll utgör en bra guide för epigenetisk forskning, vilket minskar mänskliga fel under processen och möjliggör framgångsrik dataanalys och jämförbarhet mellan olika studier.
Enligt våra resultat är DNA-metyleringsexperiment lämpliga för studier som jämför individer med och utan fetma43. Den föreslagna bioinformatikanalysen gav också högkvalitativa data och kunde övervägas i storskaliga studier.
Med hjälp av SVD-analysen identifierade vi att de fetma-relaterade egenskaperna (BMI, WC och FM) påverkade variationen i DNA-metyleringsdata. Som ett signifikant resultat indikerar celltypsuppskattningen att både naturliga mördarceller (NK) och B-celler var högre hos kvinnor med fetma än hos kvinnor utan fetma (Figur 5). Det högre antalet av dessa celler kan förklaras av dessa individers låggradiga inflammatoriska tillstånd44. Vi observerade att patienter med fetma har hypo- och hypermetylerade CpGs i promotorregioner av gener associerade med fettmassa. De flesta av platserna var hypometylerade, vilket kan relateras till den naturliga ökningen av reaktiva syrearter (ROS) nivåer hos dessa individer. Detta oxidativa stresstillstånd kan främja guaninstörning vid dinukleotidstället, bilda 8-hydroxi-2′-deoxiguanosin (8-OHdG), vilket resulterar i en 5mCp-8-OHdG dinukleotidplats och orsakar rekrytering av TET-enzymer. Alla dessa händelser kan vara ansvariga för att främja DNA-hypometylering och hypermetylering genom olika verkningsmekanismer45.
Dessutom verkar graden av adipogenes öka hos individer med fetma, med cirka 10% av nya celler till gamla celler46,47. Epigenetiska bidrag, med betoning på den obesogena miljön, kan förändra cellernas proliferations- och differentieringshastigheter, vilket gynnar utvecklingen av fettmassa48. Epigenetiska förändringar kan också påverka adipogena program, underlätta eller begränsa deras utveckling. Primära transkriptionsfaktorer (PPARγ eller C / EBPα) eller sammansättningen av multiproteinkomplex, placerade i nedströms promotorregioner som drivs av att inkludera eller utesluta epigenetiska modifierande enzymer, reglerar genuttryck genom hyper- eller hypometylering45. PPARγ-vägen har tidigare beskrivits för att förändra WNT-vägen, som hade gener berikade i denna studie. Även om det fortfarande är okänt hur WNT-signalering sker under adipogenesen har nya studier rapporterat att det kan ha viktiga roller i adiptocytmetabolismen, särskilt under obesogena förhållanden49.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) för att vara tillgänglig för att svara på alla tvivel om ChAMP-paketet. Vi tackar också Guilherme Telles, Msc. för hans bidrag både till de tekniska och vetenskapliga frågorna från denna uppsats; han gjorde viktiga överväganden angående epigenetik och videoinspelnings- och formateringstekniker (guilherme.telles@usp.br). Finansiering av förbrukningsvaror: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) och National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Personlig finansiering: (FAPESP: # 2014/16740-6) och Academic Excellence Program från Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES: 88882.180020/2018-01). Uppgifterna kommer att offentliggöras och fritt tillgängliga utan begränsningar. Adresskorrespondens till NYN (e-post: nataliayumi@usp.br) eller CBN (e-post: carla@fmrp.usp.br).
Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q – RJL System | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
NaOH | F. MAIA | 114700 | |
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |