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Medicina

Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

Published: May 31, 2021
doi:
10.3791/62600
, , ,
1Allergy Unit,Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group,Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología,Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina,Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory,Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND

Summary

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell’attivazione dei basofili de presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Abstract

Il test di attivazione dei basofili (BAT) è un test diagnostico complementare in vitro che può essere utilizzato de aggiunta alla storia clinica, al test cutaneo (ST) e alla determinazione specifica delle IgE (sIgE) nella valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate al cibo, al veleno degli insetti, ai farmaci e ad alcune forme di orticaria cronica. Tuttavia, il ruolo di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinato.

La BAT si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all’attivazione incrociata delle IgE allergene/farmaco attraverso la misurazione di marcatori di attivazione (come CD63, CD203c) mediante citometria a flusso. Questo test può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere prese in considerazione se i) l’allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) non esiste una fonte di allergeni/farmaci da utilizzare per la determinazione di ST o sIgE; iii) vi è discordanza tra la storia del paziente e la determinazione ST o sIgE; iv) i sintomi suggeriscono che la ST può provocare una risposta sistemica; v) prima di prendere in considerazione un CCT per confermare l’allergene/farmaco colpevole. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, soprattutto nell’allergia ai farmaci, alla necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l’estrazione del campione e alla mancanza di standardizzazione tra i laboratori in termini di procedure, concentrazioni e marcatori cellulari.

Introduction

La diagnosi allergica IgE-mediata si basa sull’anamnesi, sui test cutanei (ST), sulla quantificazione delle IgE sierospecifiche (sIgE) e, se richiesto e indicato, sui challenge test controllati (CCT)1,2,3,4,5,6. Tuttavia, l’anamnesi clinica può essere inaffidabile poiché potrebbe esserci una mancanza di informazioni accurate e ST e CCT non sono procedure prive di rischio che possono essere controindicate nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali 1,2,3,4,5,6 . Questi problemi, insieme al fatto che la determinazione delle sIgE mediante saggi immunoenzimatici fluoroenzimatici validati e commerciali è disponibile solo per pochi allergeni e farmaci, hanno evidenziato l’importante ruolo di altri saggi funzionali in vitro come il test di attivazione dei basofili (BAT).

I basofili sono cellule effettrici chiave coinvolte nelle reazioni allergiche IgE-mediate che si attivano in seguito al cross-linking di sE adiacenti legate su recettori ad alta affinità (FcεRI) sulla superficie cellulare dopo esposizione ad allergeni / farmaci. L’attivazione dei basofili innesca la degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori infiammatori preformati e nuovi sintetizzati contenuti nei granuli di secrezione intracitoplasmatica 7,8,9. La BAT è un metodo in vitro che cerca di imitare l’attivazione dei basofili de presenza di uno stimolo (allergene o farmaco) e determina cambiamenti nell’espressione dei marcatori di attivazione dei basofili mediante citometria a flusso 7,10. Esistono diverse strategie per identificare i basofili (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e per misurare l’attivazione cellulare (principalmente la sovraregolazione di CD63 e CD203c) utilizzando combinazioni di anticorpi marcati con fluorocromo 7,10. CD63, il miglior marcatore di attivazione clinicamente validato 11,12,13,14, è una proteina di membrana ancorata ai granuli secretori contenente istamina che, dopo attivazione cellulare e fusione dei granuli con la membrana, è espressa sulla superficie basofila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c è un marcatore di superficie che è costitutivamente espresso sui basofili e sovraregolato dopo stimolazione FcεRI, che ha anche mostrato risultati affidabili in BAT 15,22,23,24,25. Inoltre, sembra co-esprimere con CD6326.

Negli ultimi decenni, la BAT ha dimostrato di essere utile nella diagnosi di reazioni allergiche IgE-mediate indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica, come descritto di seguito. Tuttavia, la posizione di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinata.

Ipersensibilità ai farmaci
La BAT ha dimostrato di essere utile come test complementare per farmaci e pazienti selezionati, in particolare per coloro che manifestano reazioni gravi a causa del fatto che il valore diagnostico della ST non è ben stabilito per la maggior parte dei farmaci, in quanto sono validati e standardizzati per un numero limitato di farmaci27,28,29,30. Inoltre, la quantificazione delle sIgE è disponibile solo per un numero limitato di farmaci, con sensibilità inferiore a ST 27,28,29,30,31,32. Pertanto, la diagnosi di ipersensibilità ai farmaci di solito si basa sul test di provocazione farmacologica, che può essere controindicato nei soggetti che manifestano gravi reazioni pericolose per la vita33.

Sono stati riportati risultati promettenti per l’uso di BAT in pazienti selezionati che hanno riportato reazioni di ipersensibilità immediata a diversi farmaci come betalattamici (BL)20,34,35,36,37,38,39, agenti bloccanti neuromuscolari (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorochinoloni (FQs)46,47,48,49, pirazoloni 50,51,52, mezzi di contrasto radiocontrastanti (RCM)53,54,55,56 e composti di platino57,58,59 . È stato riportato che le BAT hanno una sensibilità e una specificità comprese rispettivamente tra il 51,7-66,9% e l’89,2-97,8%; e i valori predittivi positivi e negativi sono descritti tra il 93,4% e il 66,3%, rispettivamente27,31. Inoltre, la BAT è stata proposta come biomarcatore predittivo per le reazioni breakthrough durante la desensibilizzazione con composti di platino, poiché l’espressione di CD203c è aumentata rispetto a CD63 in pazienti con alto rischio di reazioni avverse durante la desensibilizzazione del farmaco57.

È da notare che la BAT è utile solo nell’ipersensibilità ai farmaci quando la reazione comporta la degranulazione dei basofili; pertanto, non è utile nelle reazioni derivanti dall’inibizione enzimatica della cicloossigenasi 142.

Allergia alimentare
La BAT è emersa come un potenziale strumento diagnostico per l’allergia alimentare perché la determinazione delle sIgE sieriche all’intero estratto allergenico o ai singoli allergeni è spesso ambigua, richiedendo la sfida alimentare orale per confermare la diagnosi, che, analogamente all’ipersensibilità ai farmaci, è una procedura costosa e non priva di rischi60. Diversi studi hanno mostrato risultati rilevanti con latte vaccino 61,62, uovo 61,63, frumento 64,65,66,67,68, arachidi 63,69,70,71,72, nocciola 73,74,75,76 ,77, crostacei78, pesca 79,80,81, mela21, sedano e carota82,83.

Il principale valore aggiunto delle BAT nella diagnosi di allergia alimentare rispetto alle ST e alle sIgE nel siero è che mostra una maggiore specificità e una sensibilità simile. Pertanto, la BAT è uno strumento utile per differenziare i pazienti clinicamente allergici da soggetti sensibilizzati, ma tolleranti, che hanno sia un’elevata specificità (75-100%) che sensibilità (77-98%)63,69,84. I valori di sensibilità e specificità dipendono dall’allergene e da altri fattori come fenotipi (ad esempio, sindrome allergica orale contro anafilassi), età e modelli di sensibilizzazione legati alla geografia63,85.

Le BAT che utilizzano singoli componenti allergenici possono potenzialmente migliorare l’accuratezza diagnostica per alcuni allergeni alimentari61,80. Esistono studi che utilizzano proteine di stoccaggio dei semi (ad esempio, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 da arachidi)86; proteine di trasferimento lipidico (ad esempio, Pru p 3 dalla pesca e Ara h 9 dall’arachide)80,86; e Bet v 1 omologhi (ad esempio, Ara h 8 da arachidi)87. Altre potenziali utilità sono legate all’identificazione dell’allergene colpevole nei casi di sindrome da allergia ai pollini 21,87,88, allergia alla carne rossa 89 o anafilassi indotta dall’esercizio fisico dipendentedal cibo 66.

È interessante notare che la BAT può fornire informazioni sulla gravità e la soglia delle reazioni allergiche poiché i pazienti con reazioni più gravi mostrano una percentuale maggiore di basofili attivati, come osservato negli studi su pazienti allergici al latte di arachidi e latte vaccino 84,90,91; e i pazienti che reagiscono a tracce dell’allergene mostrano una maggiore sensibilità basofila 84,90,92. Questi dati suggeriscono che le BAT possono essere utili per identificare i pazienti allergici ad alto rischio che richiedono un follow-up più attento e un’istruzione più intensa93. Inoltre, è stato riportato che le BAT possono prevedere le risposte di sfida alimentare 70,91,92,94 e le soglie di reattività90,95 per aiutare a determinare quando il cibo può essere (re)introdotto in modo sicuro 84. Tuttavia, questi risultati sono controversi in alcuni studi63,96 e sono necessarie ulteriori ricerche.

D’altra parte, il BAT è stato utilizzato per monitorare la risoluzione dell’allergia alimentare, sia naturalmente che sotto trattamenti immunomodulatori, nel tempo, che fino ad ora è stata valutata solo per via orale, con i rischi e i costi associati 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Inoltre, è stato anche usato per monitorare l’effetto di omalizumab nell’allergia alimentare poiché l’attivazione dei basofili diminuisce durante il trattamento con omalizumab, ma aumenta dopo la cessazione del trattamento109.

Allergia inalante
La BAT è raramente benefica nell’allergia inalante poiché la diagnosi può essere stabilita di routine mediante quantificazione delle IgE e ST. Tuttavia, nei casi di rinite allergica locale (livelli non rilevabili di sIgE e ST negative con test di provocazione nasale positivi), la BAT ha permesso la diagnosi nel 50% dei casi110. È stata inoltre riportata una correlazione tra sensibilità ai basofili e risposta ai test di provocazione nasale/bronchiale, nonché tra gravità dell’asma ed efficacia del trattamento con omalizumab111.112.

Il BAT è stato utilizzato anche per monitorare l’immunoterapia con allergeni per acari della polvere domestica e pollini, poiché la sensibilità dei basofili diminuisce durante l’immunoterapia, probabilmente a causa dell’interferenza degli anticorpi IgG bloccanti 113.114.115.116.117.

Allergia al veleno degli imenotteri
La diagnosi di allergia al veleno degli imenotteri si basa di routine sulla ST e sulle sIgE sieriche. La BAT ha mostrato un’elevata sensibilità (85-100%) e specificità (83-100%) ed è stata riportata come utile nei casi che producono risultati equivoci o in pazienti con una storia clinica suggestiva di allergia al veleno ma sIgE non rilevabile e ST118.119 negativa. Tuttavia, la BAT non sembra essere predittiva della gravità di queste reazioni120.121.

Fino al 60% dei pazienti presenta sIgE sia alla vespa che al veleno d’api e l’identificazione dell’allergene dominante è fondamentale per un adeguato trattamento immunoterapico. In questi casi, il BAT è stato segnalato per essere utile nell’identificazione dell’allergene dominante 119,122,123,124. Sebbene le sIgE ai principali allergeni dei veleni di api e vespe possano ridurre l’utilità della BAT nei pazienti con doppia positività ad entrambi i veleni, fornisce informazioni utili principalmente in soggetti con risultati negativi nelle determinazioni delle sIgE123.

Alcuni studi suggeriscono che il BAT può essere utile come biomarcatore predittivo per gli effetti collaterali durante la fase di accumulo dell’immunoterapia del veleno poiché questa opzione di trattamento è stata segnalata per ridurre la sensibilità dei basofili. Tuttavia, la reattività non diminuisce e questa utilità BAT è oggi controversa 13,120,125,126,127,128,129,130.

Orticaria e angioedema
Un sottogruppo di pazienti con orticaria cronica ha una fisiopatologia autoimmune, dovuta agli autoanticorpi IgE contro gli autoallergeni e agli autoanticorpi IgG che colpiscono i complessi FcεRI o IgE-FcεRI presenti sulla superficie dei mastociti131.132. Nella pratica clinica, la diagnosi di questo tipo di orticaria cronica si è basata su ST sierico autologo positivo, che ha il rischio di infezione accidentale. La BAT è stata proposta come test in vitro per la diagnosi e il monitoraggio dei pazienti con sospetta orticaria cronica. È stato riportato che sia l’espressione di CD63 che quella di CD203c sulla superficie dei basofili sono aumentate in seguito alla stimolazione con sieri di pazienti con orticaria cronica, mostrando la rilevazione di autoanticorpi attivi 133.134.135.136.137. Recentemente, è stato riportato che i pazienti con BAT positivo spesso sperimentano lo stato di malattia più attivo, valutato dal punteggio di attività dell’orticaria, e richiedono dosi più elevate di antistaminici insieme a trattamenti di terza linea (ciclosporina A o omalizumab), rispetto a quelli con BAT138 negativo.

Protocol

L’esecuzione del protocollo è stata condotta secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvata dal Comitato Etico locale (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spagna). Tutti i soggetti sono stati informati oralmente dello studio di ricerca e hanno firmato il corrispondente modulo di consenso informato. NOTA: Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura BAT che gli autori utilizzano quotidianamente. Tuttavia, questo non è un metodo…

Representative Results

La BAT eseguita con allergeni o farmaci consente di studiare le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti. La reattività dei basofili deve essere misurata in almeno due concentrazioni ottimali per ottenere i migliori risultati34 e l’attivazione viene visualizzata dalla sovraregolazione di CD63 sulla superficie cellulare. Nel caso di allergeni, inoltre, per confermare la reattività dei basofili, la sensibilità dei basofili dovrebbe essere analizzata misurando la reattività a concentrazioni mu…

Discussion

La BAT è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si è dimostrato utile nella diagnosi di reazioni indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, alimenti o inalanti, nonché de alcune forme di orticaria cronica. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere considerate se i) l’allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) l’allergene/farmaco non è disponibile per essere utilizzato per la quantificazione ST o sIgE; ii…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Claudia Corazza per il suo prezioso supporto in lingua inglese. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Istituto di Sanità ”Carlos III” (ISCIII) del MINECO (sovvenzione cofinanziata dal FESR: “Una manera de hacer Europa”; Sovvenzioni n. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministero regionale andaluso della sanità (concessione n. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID è uno sperimentatore clinico (B-0001-2017) e AA detiene un contratto post-dottorato senior (RH-0099-2020), entrambi supportati dal Ministero della Salute regionale andaluso (cofinanziato da ESF: “Andalucía se mueve con Europa”).

Materials

5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
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Keywords: Basophil Activation TestAllergy DiagnosisIgE-mediated Allergic ReactionsFlow CytometryActivation MarkersDrug AllergyAllergenPositive ControlFMLPAnti-IgEStaining MixCCR3-APCCD203c-PECD63-FITCPBS-T
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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).
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