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Medicina

Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia

Published: May 31, 2021
doi:
10.3791/62600
, , ,
1Allergy Unit,Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group,Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología,Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina,Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory,Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND

Summary

O teste de ativação basófila é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE com base na detecção de ativação basofílica na presença de um estímulo específico através da medida de marcadores de ativação por citometria de fluxo.

Abstract

O teste de ativação basofílica (BAT) é um teste complementar de diagnóstico in vitro que pode ser usado além da história clínica, teste cutâneo (ST) e determinação específica de IgE (sIgE) na avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE a alimentos, veneno de inseto, drogas, bem como algumas formas de urticária crônica. No entanto, o papel dessa técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinado.

A MTD baseia-se na determinação da resposta basófila à ativação de IgE de ligação transfronteiriça alérgeno/fármaco através da medição de marcadores de ativação (como CD63, CD203c) por citometria de fluxo. Este teste pode ser uma ferramenta útil e complementar para evitar testes de desafio controlados para confirmar o diagnóstico de alergia, especialmente em indivíduos que experimentam reações graves com risco de vida. Em geral, o desempenho da MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) não há fonte de alérgeno/fármaco a ser utilizada para determinação de ST ou sIgE; iii) há discordância entre a história do paciente e a determinação de ST ou sIgE; iv) os sintomas sugerem que o TS pode resultar em resposta sistêmica; v) antes de considerar uma TCC para confirmar o alérgeno/droga culpado. As principais limitações do teste estão relacionadas à sensibilidade não ótima, principalmente na alergia a medicamentos, à necessidade de realizar o teste não mais de 24 h após a extração da amostra e à falta de padronização entre os laboratórios em termos de procedimentos, concentrações e marcadores celulares.

Introduction

O diagnóstico de alergia mediada por IgE é baseado na história clínica, testes cutâneos (STs), quantificação de IgE sérica específica (sIgE) e, se necessário e indicado, testes de desafio controlado (CCTs)1,2,3,4,5,6. No entanto, a história clínica pode não ser confiável, uma vez que pode haver falta de informações precisas, e STs e CCTs não são procedimentos isentos de risco que podem ser contraindicados em indivíduos com reações graves com risco de vida 1,2,3,4,5,6 . Essas questões, juntamente com o fato de que a determinação de sIgE por imunoensaios fluoroenzimáticos validados e comerciais só está disponível para poucos alérgenos e drogas, destacaram o importante papel de outros ensaios funcionais in vitro, como o teste de ativação basófila (BAT).

Os basófilos são células-chave efetoras envolvidas em reações alérgicas mediadas por IgE que são ativadas após a reticulação de sIgE adjacente ligada a receptores de alta afinidade (FcεRI) na superfície celular após exposição a alérgenos/medicamentos. A ativação basófila desencadeia a degranulação celular e a liberação de mediadores inflamatórios pré-formados e novos sintetizados contidos nos grânulos de secreção intracitoplasmática 7,8,9. A MTD é um método in vitro que tenta mimetizar a ativação basófila na presença de um estímulo (alérgeno ou droga) e determina alterações na expressão de marcadores de ativação basófila por citometria de fluxo 7,10. Existem diferentes estratégias para identificar basófilos (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e medir a ativação celular (principalmente regulação positiva de CD63 e CD203c) usando combinações de anticorpos marcados com fluorocromo 7,10. O CD63, o melhor marcador de ativação clinicamente validado 11,12,13,14, é uma proteína de membrana ancorada nos grânulos secretores contendo histamina que, após ativação celular e fusão dos grânulos com a membrana, é expressa na superfície basófila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c é um marcador de superfície que é expresso constitutivamente em basófilos e regulado positivamente após a estimulação de FcεRI, que também mostrou resultados confiáveis em MTD 15,22,23,24,25. Além disso, parece co-expressar com CD6326.

Nas últimas décadas, o MTD tem se mostrado útil no diagnóstico de reações alérgicas mediadas por IgE induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica, conforme descrito a seguir. No entanto, a posição desta técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinada.

Hipersensibilidade a medicamentos
A MTD tem se mostrado útil como exame complementar para medicamentos e pacientes selecionados, particularmente para aqueles que apresentam reações graves, devido ao fato de que o valor diagnóstico do TS não está bem estabelecido para a maioria dos medicamentos, pois são validados e padronizados para um número limitado de medicamentos27,28,29,30. Além disso, a quantificação de sIgE está disponível apenas para um número limitado de fármacos, com menor sensibilidade que o ST 27,28,29,30,31,32. Portanto, o diagnóstico de hipersensibilidade medicamentosa geralmente depende do teste de provocação medicamentosa, que pode ser contraindicado em indivíduos que apresentam reações graves com risco de vida33.

Resultados promissores têm sido relatados para o uso de MTD em pacientes selecionados que relataram reações de hipersensibilidade imediata a diferentes fármacos como betalactâmicos (BLs)20,34,35,36,37,38,39, agentes bloqueadores neuromusculares (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonas (FQs)46,47,48,49, pirazolonas 50,51,52, meios de radiocontraste (RCM)53,54,55,56 e compostos de platina 57,58,59 . Foi relatado que a MTD tem uma sensibilidade e especificidade entre 51,7-66,9% e 89,2-97,8%, respectivamente; e os valores preditivos positivo e negativo variam entre 93,4% e 66,3%, respectivamente27,31. Além disso, o MTD tem sido proposto como um biomarcador preditivo para reações de avanço durante a dessensibilização com compostos de platina, uma vez que a expressão de CD203c é aumentada em comparação com CD63 em pacientes com alto risco de reações adversas durante a dessensibilização medicamentosa57.

É de notar que o MTD só é útil na hipersensibilidade a medicamentos quando a reação envolve degranulação basófila; portanto, não é útil em reações resultantes da inibição enzimática da ciclooxigenase 142.

Alergia alimentar
A MTD emergiu como uma potencial ferramenta diagnóstica para alergia alimentar, pois a determinação de sIgE sérica para todo o extrato alergênico ou alérgenos únicos é muitas vezes ambígua, exigindo desafio alimentar oral para confirmar o diagnóstico, o que, da mesma forma que a hipersensibilidade a medicamentos, é um procedimento caro e não isento de risco60. Vários estudos têm mostrado resultados relevantes com leite de vaca 61,62, ovo 61,63, trigo 64,65,66,67,68, amendoim 63,69,70,71,72, avelã 73,74,75,76 ,77, marisco78, pêssego 79,80,81, maçã21, aipo e cenoura 82,83.

O principal valor agregado da MTD no diagnóstico de alergia alimentar em comparação com STs e sIgE no soro é que ela apresenta maior especificidade e sensibilidade semelhante. Assim, a MTD é uma ferramenta útil para diferenciar pacientes clinicamente alérgicos de indivíduos sensibilizados, mas tolerantes, que apresentam alta especificidade (75-100%) e sensibilidade (77-98%)63,69,84. Os valores de sensibilidade e especificidade dependem do alérgeno e de outros fatores como fenótipos (por exemplo, síndrome de alergia oral versus anafilaxia), idade e padrões de sensibilização relacionados à geografia63,85.

A MTD usando componentes alergênicos únicos pode potencialmente melhorar a precisão diagnóstica para alguns alérgenos alimentares61,80. Existem estudos utilizando proteínas de armazenamento de sementes (por exemplo, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 do amendoim)86; proteínas de transferência lipídica (por exemplo, Pru p 3 do pêssego e Ara h 9 do amendoim)80,86; e Bet v 1 homólogos (por exemplo, Ara h 8 de amendoim)87. Outras utilidades potenciais estão relacionadas à identificação do alérgeno culpado em casos de síndrome de alergia alimentar ao pólen 21,87,88, alergia à carne vermelha 89 ou anafilaxia induzida por exercício dependente de alimentos66.

Curiosamente, a MTD pode fornecer informações sobre a gravidade e o limiar das reações alérgicas, uma vez que pacientes com reações mais graves apresentam maior proporção de basófilos ativados, como observado em estudos com pacientes alérgicos ao amendoim e ao leite de vaca 84,90,91; e os pacientes que reagem a vestígios do alérgeno apresentam maior sensibilidade basófila 84,90,92. Esses dados sugerem que a MTD pode ser útil para identificar pacientes alérgicos de alto risco que necessitam de acompanhamento mais próximo e educação mais intensificada93. Além disso, tem sido relatado que a MTD pode prever respostas de desafio alimentar 70,91,92,94 e limiares de reatividade90,95 para ajudar a determinar quando os alimentos podem ser (re)introduzidos com segurança 84. No entanto, esses achados são controversos em alguns estudos63,96 e mais pesquisas são necessárias.

Por outro lado, a MTD tem sido utilizada para monitorar a resolução da alergia alimentar, seja naturalmente ou sob tratamentos imunomoduladores, ao longo do tempo, que até o momento só tem sido avaliada por desafio alimentar oral, com os riscos e custos associados 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Além disso, também tem sido usado para monitorar o efeito do omalizumabe na alergia alimentar, pois a ativação basofílica diminui durante o tratamento com omalizumabe, mas aumenta após a cessação do tratamento109.

Alergia a inalantes
A MTD raramente é benéfica na alergia inalatória, pois o diagnóstico pode ser rotineiramente estabelecido pela quantificação de sIgE e ST. Entretanto, nos casos de rinite alérgica local (níveis indetectáveis de sIgE e STs negativos com testes de provocação nasal positivos), a MTD permitiu o diagnóstico em 50% dos casos110. Foi ainda relatada uma correlação entre a sensibilidade basofílica e a resposta aos testes de provocação nasal/brônquica, bem como entre a gravidade da asma e a eficácia do tratamento com omalizumabe111,112.

A MTD também tem sido usada para monitorar a imunoterapia alergênica para ácaros e pólenes da poeira doméstica, uma vez que a sensibilidade basófila diminui durante a imunoterapia, provavelmente devido à interferência dos anticorpos IgG bloqueadores 113,114,115,116,117.

Alergia ao veneno de himenópteros
O diagnóstico de alergia ao veneno de himenópteros é rotineiramente baseado em ST e sIgE sérica. A MTD mostrou alta sensibilidade (85-100%) e especificidade (83-100%) e tem sido relatada como útil em casos que produzem resultados equívocos ou em pacientes com história clínica sugestiva de alergia ao veneno, mas sIgE indetectável e ST118,119 negativos. No entanto, a MTD parece não ser preditiva de gravidade para essas reações120,121.

Até 60% dos pacientes apresentam sIgE tanto para o veneno de vespa quanto de abelha, e a identificação de alérgeno dominante é crucial para o tratamento adequado da imunoterapia. Nesses casos, a MTD tem sido relatada como útil na identificação do alérgeno dominante 119,122,123,124. Embora a sIgE para os principais alérgenos dos venenos de abelha e vespa possa reduzir a utilidade da MTD em pacientes com dupla positividade para ambos os venenos, ela fornece informações úteis principalmente em indivíduos com resultados negativos nas determinações de sIgE123.

Alguns estudos sugerem que o MTD pode ser útil como um biomarcador preditivo para efeitos colaterais durante a fase de acúmulo de imunoterapia com veneno, uma vez que essa opção de tratamento tem sido relatada para diminuir a sensibilidade basófila. No entanto, a reatividade não diminui e essa utilidade MTD é hoje controversa 13.120.125.126.127.128.129.130.

Urticária e angioedema
Um subconjunto de pacientes com urticária crônica apresenta fisiopatologia autoinsumível, devido a autoanticorpos IgE para autoalérgenos e autoanticorpos IgG que têm como alvo complexos FcεRI ou IgE-FcεRI presentes na superfície dos mastócitos131,132. Na prática clínica, o diagnóstico desse tipo de urticária crônica tem se baseado no ST sérico autólogo positivo, que apresenta risco de infecção acidental. A MTD tem sido proposta como um teste in vitro para diagnosticar e monitorar pacientes com suspeita de urticária crônica. Foi relatado que a expressão de CD63 e CD203c na superfície dos basófilos está aumentada após a estimulação com soros de pacientes com urticária crônica, mostrando a detecção de autoanticorpos ativos 133,134,135,136,137. Recentemente, tem sido relatado que pacientes com MTD positiva frequentemente experimentam o estado de doença mais ativo, avaliado pelo escore de atividade da urticária, e requerem doses mais altas de anti-histamínicos juntamente com tratamentos de terceira linha (ciclosporina A ou omalizumabe), em comparação com aqueles com MTD138 negativos.

Protocol

O desempenho do protocolo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsínquia e aprovado pelo Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Espanha. Todos os sujeitos foram informados oralmente sobre o estudo de pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido correspondente. NOTA: O presente protocolo detalha o procedimento BAT que os autores usam diariamente. No entanto, este não é um método padronizado e existem diferença…

Representative Results

A MTD realizada com alérgenos ou drogas permite a investigação de reações de hipersensibilidade dependentes de IgE. A reatividade basófila deve ser medida em pelo menos duas concentrações ótimas, a fim de obter os melhores resultados34 e a ativação é visualizada pela regulação positiva do CD63 na superfície celular. No caso dos alérgenos, além disso, para confirmar a reatividade basófila, a sensibilidade basófila deve ser analisada medindo-se a reatividade em múltiplas concentr…

Discussion

A MTD é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE que tem se mostrado útil no diagnóstico de reações induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica. Em geral, o desempenho das MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) o alérgeno/fármaco não está disponível para ser utilizado para quantificação de ST o…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Claudia Corazza por seu inestimável suporte em inglês. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Saúde ”Carlos III” (ISCIII) do MINECO (subvenção co-financiada pelo FEDER: “Una manera de hacer Europa”; Subvenções n.º PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (Grant Nos. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). A ID é Investigadora Clínica (B-0001-2017) e a AA detém um Contrato de Pós-Doutoramento Sénior (RH-0099-2020), ambos apoiados pelo Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (cofinanciado pelo FSE: “Andalucía se mueve con Europa”).

Materials

5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).
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