使用膜片钳技术研究线粒体的产热能力
Summary
该方法文章详细介绍了使用膜片钳技术测量穿过线粒体内膜的H + 泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。
Abstract
线粒体产热（也称为线粒体解耦）是增加能量消耗以对抗代谢综合征的最有希望的目标之一。产热组织，如棕色和米色脂肪，发展出高度专业化的线粒体用于产热。主要产生ATP的其他组织的线粒体也将高达25%的总线粒体能量产生转化为热量，因此可以对整个身体的生理学产生相当大的影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，而且可以防止饮食引起的肥胖并减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节剂，因此对这一基本过程的机械理解将有助于开发治疗策略，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。重要的是，控制线粒体中产热急性激活的精确分子机制定义不清。这种信息的缺乏主要是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法。最近应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次使在线粒体产热起源的现象，通过IMM泄漏H + 以及负责它的线粒体转运蛋白的第一次生物物理表征，解偶蛋白1（UCP1），棕色和米色脂肪的特异性以及所有其他组织的ADP / ATP转运蛋白（AAC）的直接研究。这种独特的方法将为控制H + 泄漏和线粒体产热的机制以及如何靶向对抗代谢综合征提供新的见解。本文描述了应用于线粒体的膜片钳方法，通过直接测量通过IMM的H + 电流来研究其产热能力。
Introduction
线粒体以细胞的动力而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体也会产生热量。事实上，每个线粒体不断产生两种类型的能量（ATP和热量），并且两种能量形式之间的良好平衡定义了代谢细胞稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量当然是生物能量学领域最基本的问题，尽管它在很大程度上仍然是未知的。我们确实知道，增加线粒体产热（称为线粒体产热），从而减少ATP的产生会增加能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳方法之一1。
线粒体产热起源于穿过线粒体内膜（IMM）的H + 泄漏，导致底物氧化和ATP合成的解耦，从而产生热量，因此称为“线粒体解耦”1 （图1）。这种H + 泄漏取决于称为解偶联蛋白（UCP）的线粒体转运蛋白。UCP1是第一个被识别的UCP。它仅以产热组织，棕色脂肪和米色脂肪表达，其中线粒体专门用于产热2，3，4。UCP在骨骼肌，心脏和肝脏等非脂肪组织中的身份仍然存在争议。这些组织中的线粒体可使约25%的总线粒体能量转化为热量，这可以显着影响整个身体的生理机能1.除了保持核心体温外，线粒体产热还通过减少卡路里来预防饮食引起的肥胖。此外，它通过线粒体减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤1。因此，线粒体产热参与正常衰老，年龄相关的退行性疾病和其他涉及氧化应激的疾病，例如缺血再灌注。因此，线粒体产热是细胞代谢的强大调节剂，对这一基本过程的机制理解将促进治疗策略的发展，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。
线粒体呼吸是第一个揭示线粒体产热在细胞代谢中的关键作用的技术，并且仍然是社区中最受欢迎的技术1。该技术基于线粒体电子传递链（ETC）对氧消耗量的测量，当线粒体H +泄漏被激活时，线粒体电子传递链（ETC）会增加。这种技术虽然是工具性的，但不能直接研究IMM1上的线粒体H +泄漏，因此很难精确识别和表征负责它的蛋白质，特别是在非脂肪组织中，与ATP产生相比，热量产生是次要的。最近，应用于线粒体的膜片钳技术的发展，首次直接研究了各种组织中整个IMM的H +泄漏5，6，7。
整个IMM的线粒体膜片钳首先由Kirichok等人以可重复的方式建立。他们描述了2004年使用来自COS-7细胞系8的斜面体首次直接测量线粒体钙单递质细胞（MCU）电流。后来，Kirichok实验室显示来自小鼠9和果蝇组织9的IMM的钙电流。其他实验室现在经常使用这种技术来研究MCU10，11，12，13，14的生物物理特性。对钾和氯化物电导率进行全IMM膜片钳分析也是可能的，并且已经在几篇论文中提到过，但尚未成为出版物6，7，9的主题。2012年报道了对IMM上H +电流的首次测量，来自小鼠棕色脂肪线粒体6，以及2017年小鼠米色脂肪线粒体7。该电流是由于产热组织的特异性解偶联蛋白UCP16，7。2019年发表的最新研究将AAC描述为负责心脏和骨骼肌等非脂肪组织中线粒体H +泄漏的主要蛋白质5。
这种独特的方法现在允许对负责线粒体产热的线粒体离子通道和转运蛋白进行直接的高分辨率功能分析。为了促进该方法的扩展并补充其他研究，例如线粒体呼吸，下面描述了测量UCP1和AAC携带的H + 电流的详细方案。描述了三个重要步骤：1）从小鼠棕色脂肪中分离线粒体以分析UCP1依赖性H + 电流和从心脏中分离线粒体以分析AAC依赖性H + 电流，2）用法国压榨机制备斜面体以机械破裂外线粒体膜（OMM），3）整个IMM上UCP1和AAC依赖性H + 电流的膜片钳记录。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法文章旨在介绍最近应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种通过负责线粒体产热的IMM直接研究H + 泄漏的新方法5，6，7，15。该技术不仅限于组织，还可用于分析不同标准人体和细胞模型（如HAP1，COS7，C2C12和MEF细胞）中IMM的H + 泄漏和其他电导。然而，每个线粒体分离都需要针对每?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我感谢Yuriy Kirichok博士在他的实验室中参与的伟大科学，并感谢Kirichok实验室的成员进行了有益的讨论。我还要感谢Douglas C. Wallace博士提供 AAC1 敲除小鼠。 资助：A.M.B.由美国心脏协会职业发展奖19CDA34630062支持。
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
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