Anvendelsen af plasterklemmeteknikken til at studere mitokondriernes termogene kapacitet

Summary

Denne metodeartikel beskriver de vigtigste trin i måling af H ⁺ lækage over den indre mitokondriemembran med patch-clamp teknikken, en ny tilgang til at studere mitokondriernes termogene kapacitet.

Abstract

Mitokondriel termogenese (også kendt som mitokondriel afkobling) er et af de mest lovende mål for at øge energiforbruget til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Termogene væv som brune og beige fedtstoffer udvikler højt specialiserede mitokondrier til varmeproduktion. Mitokondrier af andre væv, der primært producerer ATP, omdanner også op til 25% af den samlede mitokondrielle energiproduktion til varme og kan derfor have en betydelig indvirkning på hele kroppens fysiologi. Mitokondriel termogenese er ikke kun afgørende for at opretholde kropstemperaturen, men forhindrer også diætinduceret fedme og reducerer produktionen af reaktive iltarter (ROS) for at beskytte celler mod oxidativ skade. Da mitokondriel termogenese er en vigtig regulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces hjælpe med udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion. Det er vigtigt, at de præcise molekylære mekanismer, der styrer akut aktivering af termogenese i mitokondrier, er dårligt defineret. Denne mangel på information skyldes i høj grad mangel på metoder til direkte måling af afkoblingsproteiner. Den nylige udvikling af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier muliggjorde for første gang den direkte undersøgelse af fænomenet ved oprindelsen af mitokondriel termogenese, H ⁺ lækage gennem IMM og den første biofysiske karakterisering af mitokondrielle transportører, der er ansvarlige for det, afkoblingsproteinet 1 (UCP1), der er specifikt for brune og beige fedtstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre væv. Denne unikke tilgang vil give ny indsigt i de mekanismer, der styrer H ⁺ lækage og mitokondriel termogenese, og hvordan de kan målrettes til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Dette papir beskriver den patch-clamp-metode, der anvendes på mitokondrier til at studere deres termogene kapacitet ved direkte at måle H ⁺ -strømme gennem IMM.

Introduction

Mitokondrier er berømte for at være cellens kraftværk. Faktisk er de den største kilde til kemisk energi, ATP. Hvad der er mindre kendt er, at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokondrie konstant de to typer energier (ATP og varme), og en fin balance mellem de to energiformer definerer metabolisk cellehomeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier fordeler energi mellem ATP og varme er bestemt det mest grundlæggende spørgsmål inden for bioenergetik, selvom det stadig er stort set ukendt. Vi ved, at øget mitokondriel varmeproduktion (kaldet mitokondriel termogenese) og dermed reduktion af ATP-produktionen øger energiforbruget, og dette er en af de bedste måder at bekæmpe metabolisk syndrom¹ på.

Mitokondriel termogenese stammer fra H ⁺ lækage over den indre mitokondriemembran (IMM), hvilket fører til afkobling af substratoxidation og ATP-syntese med deraf følgende produktion af varme, deraf navnet “mitokondriel afkobling”¹ (figur 1). Denne H ⁺ lækage afhænger af mitokondrielle transportører kaldet afkoblingsproteiner (UMP’er). UCP1 var den første UCP, der blev identificeret. Det udtrykkes kun i termogene væv, brunt fedt og beige fedt, hvor mitokondrier er specialiseret til varmeproduktion ^2,3,4. Identiteten af UCP i ikke-fedtvæv som skeletmuskulatur, hjerte og lever er forblevet kontroversiel. Mitokondrier i disse væv kan have ca. 25% af den samlede mitokondrielle energi omdannet til varme, hvilket kan påvirke fysiologien i hele kroppen betydeligt¹. Udover at opretholde kernekropstemperaturen forhindrer mitokondriel termogenese også diætinduceret fedme ved at reducere kalorierne. Derudover reducerer det produktionen af reaktive iltarter (ROS) af mitokondrier for at beskytte celler mod oxidativ skade¹. Mitokondriel termogenese er således involveret i normal aldring, aldersrelaterede degenerative lidelser og andre tilstande, der involverer oxidativ stress, såsom iskæmi-reperfusion. Derfor er mitokondriel termogenese en stærk regulator af cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces vil fremme udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion.

Mitokondriel respiration var den første teknik til at afsløre den afgørende rolle mitokondriel termogenese i cellulær metabolisme og er stadig den mest populære i samfundet¹. Denne teknik er baseret på måling af iltforbrug af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC), der stiger, når mitokondriel H ⁺ lækage aktiveres. Denne teknik, selvom den er instrumentel, kan ikke direkte studere mitokondriel H ⁺ -lækage på tværs af IMM¹, hvilket gør den nøjagtige identifikation og karakterisering af de proteiner, der er ansvarlige for den, vanskelig, især i ikke-fedtvæv, hvor varmeproduktionen er sekundær sammenlignet med ATP-produktion. For nylig gav udviklingen af patch-clamp-teknikken anvendt på mitokondrier den første direkte undersøgelse af H ⁺ lækage over hele IMM i forskellige væv ^5,6,7.

Den mitokondrielle patchklemme af hele IMM blev først etableret på en reproducerbar måde af Kirichok et ^al.8. De beskrev den første direkte måling af mitokondrie calcium uniporter (MCU) strømme i 2004 ved hjælp af mitoplaster fra COS-7 cellelinjer⁸. Senere viste Kirichok-laboratoriet calciumstrømme fra IMM’er af mus⁹ og Drosophila væv⁹. Andre laboratorier bruger nu rutinemæssigt denne teknik til at studere de biofysiske egenskaber ved MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM-plasterklemmeanalyse af kalium- og kloridkonduktans er også mulig og er blevet nævnt i flere artikler, men har endnu ikke været hovedemnet for en publikation ^6,7,9. Den første måling af H^+-strømme på tværs af IMM blev rapporteret i 2012 fra musebrune fedtmitokondrier⁶ og fra muse-beige fedtmitokondrier i 2017⁷. Denne strøm skyldes det specifikke afkoblingsprotein af termogene væv, UCP1 ^6,7. Nyligt arbejde offentliggjort i 2019 karakteriserede AAC som det vigtigste protein, der er ansvarligt for mitokondriel H ^{+ –}lækage i ikke-fedtvæv som hjerte- og skeletmuskulatur⁵.

Denne unikke tilgang giver nu mulighed for direkte højopløselig funktionel analyse af mitokondrielle ionkanaler og transportører, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese. For at lette udvidelsen af metoden og supplere andre undersøgelser såsom mitokondriel respiration er der beskrevet en detaljeret protokol nedenfor til måling af H ^{+ –} strømme, der bæres af UCP1 og AAC. Tre vigtige trin er beskrevet: 1) mitokondriel isolering fra musebrunt fedt for at analysere UCP1-afhængig H ⁺ -strøm og mitokondriel isolering fra hjertet for at analysere AAC-afhængig H ⁺ -strøm, 2) forberedelse af mitoplaster med en fransk presse til mekanisk brud på den ydre mitokondriemembran (OMM), 3) patch-clamp optagelser af UCP1 og AAC-afhængige H ⁺ strømme på tværs af hele IMM.

Protocol

Alle dyreforsøgsprocedurer, der blev udført, er i overensstemmelse med National Institutes of Health-retningslinjerne og blev godkendt af University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). BEMÆRK: Den mitokondrielle isolationsprocedure er baseret på differentiel centrifugering og varierer lidt fra væv til væv. For eksempel, da brunt fedtvæv er ekstremt rig på lipider, kræver det et ekstra trin at adskille celleaffald og organeller fra lipidfasen,…

Representative Results

Udviklingen af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier gav den første direkte undersøgelse af H + – lækage gennem IMM og mitokondrietransportørerne, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analyse af UCP1- og AAC-afhængige H + lækager kan give et første blik på mitokondriernes termogene kapacitet. Resultatafsnittet beskriver standardprocedurerne til måling af H + lækage via UCP1 og AAC. UCP1-afhængig H+-</sup…

Discussion

Denne metodeartikel har til formål at præsentere patch-clamp-teknikken, der for nylig blev anvendt på mitokondrier, en ny tilgang til direkte at studere H ⁺ lækage gennem IMM, der er ansvarlig for mitokondriel termogenese 5,6,7,15. Denne teknik er ikke begrænset til væv og kan også bruges til at analysere H ⁺ lækage og andre konduktanser af IMM i forskellige standa…

Materials

0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253