Denne metodeartikel beskriver de vigtigste trin i måling af H + lækage over den indre mitokondriemembran med patch-clamp teknikken, en ny tilgang til at studere mitokondriernes termogene kapacitet.
Mitokondriel termogenese (også kendt som mitokondriel afkobling) er et af de mest lovende mål for at øge energiforbruget til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Termogene væv som brune og beige fedtstoffer udvikler højt specialiserede mitokondrier til varmeproduktion. Mitokondrier af andre væv, der primært producerer ATP, omdanner også op til 25% af den samlede mitokondrielle energiproduktion til varme og kan derfor have en betydelig indvirkning på hele kroppens fysiologi. Mitokondriel termogenese er ikke kun afgørende for at opretholde kropstemperaturen, men forhindrer også diætinduceret fedme og reducerer produktionen af reaktive iltarter (ROS) for at beskytte celler mod oxidativ skade. Da mitokondriel termogenese er en vigtig regulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces hjælpe med udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion. Det er vigtigt, at de præcise molekylære mekanismer, der styrer akut aktivering af termogenese i mitokondrier, er dårligt defineret. Denne mangel på information skyldes i høj grad mangel på metoder til direkte måling af afkoblingsproteiner. Den nylige udvikling af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier muliggjorde for første gang den direkte undersøgelse af fænomenet ved oprindelsen af mitokondriel termogenese, H + lækage gennem IMM og den første biofysiske karakterisering af mitokondrielle transportører, der er ansvarlige for det, afkoblingsproteinet 1 (UCP1), der er specifikt for brune og beige fedtstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre væv. Denne unikke tilgang vil give ny indsigt i de mekanismer, der styrer H + lækage og mitokondriel termogenese, og hvordan de kan målrettes til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Dette papir beskriver den patch-clamp-metode, der anvendes på mitokondrier til at studere deres termogene kapacitet ved direkte at måle H + -strømme gennem IMM.
Mitokondrier er berømte for at være cellens kraftværk. Faktisk er de den største kilde til kemisk energi, ATP. Hvad der er mindre kendt er, at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokondrie konstant de to typer energier (ATP og varme), og en fin balance mellem de to energiformer definerer metabolisk cellehomeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier fordeler energi mellem ATP og varme er bestemt det mest grundlæggende spørgsmål inden for bioenergetik, selvom det stadig er stort set ukendt. Vi ved, at øget mitokondriel varmeproduktion (kaldet mitokondriel termogenese) og dermed reduktion af ATP-produktionen øger energiforbruget, og dette er en af de bedste måder at bekæmpe metabolisk syndrom1 på.
Mitokondriel termogenese stammer fra H + lækage over den indre mitokondriemembran (IMM), hvilket fører til afkobling af substratoxidation og ATP-syntese med deraf følgende produktion af varme, deraf navnet “mitokondriel afkobling”1 (figur 1). Denne H + lækage afhænger af mitokondrielle transportører kaldet afkoblingsproteiner (UMP’er). UCP1 var den første UCP, der blev identificeret. Det udtrykkes kun i termogene væv, brunt fedt og beige fedt, hvor mitokondrier er specialiseret til varmeproduktion 2,3,4. Identiteten af UCP i ikke-fedtvæv som skeletmuskulatur, hjerte og lever er forblevet kontroversiel. Mitokondrier i disse væv kan have ca. 25% af den samlede mitokondrielle energi omdannet til varme, hvilket kan påvirke fysiologien i hele kroppen betydeligt1. Udover at opretholde kernekropstemperaturen forhindrer mitokondriel termogenese også diætinduceret fedme ved at reducere kalorierne. Derudover reducerer det produktionen af reaktive iltarter (ROS) af mitokondrier for at beskytte celler mod oxidativ skade1. Mitokondriel termogenese er således involveret i normal aldring, aldersrelaterede degenerative lidelser og andre tilstande, der involverer oxidativ stress, såsom iskæmi-reperfusion. Derfor er mitokondriel termogenese en stærk regulator af cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces vil fremme udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion.
Mitokondriel respiration var den første teknik til at afsløre den afgørende rolle mitokondriel termogenese i cellulær metabolisme og er stadig den mest populære i samfundet1. Denne teknik er baseret på måling af iltforbrug af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC), der stiger, når mitokondriel H + lækage aktiveres. Denne teknik, selvom den er instrumentel, kan ikke direkte studere mitokondriel H + -lækage på tværs af IMM1, hvilket gør den nøjagtige identifikation og karakterisering af de proteiner, der er ansvarlige for den, vanskelig, især i ikke-fedtvæv, hvor varmeproduktionen er sekundær sammenlignet med ATP-produktion. For nylig gav udviklingen af patch-clamp-teknikken anvendt på mitokondrier den første direkte undersøgelse af H + lækage over hele IMM i forskellige væv 5,6,7.
Den mitokondrielle patchklemme af hele IMM blev først etableret på en reproducerbar måde af Kirichok et al.8. De beskrev den første direkte måling af mitokondrie calcium uniporter (MCU) strømme i 2004 ved hjælp af mitoplaster fra COS-7 cellelinjer8. Senere viste Kirichok-laboratoriet calciumstrømme fra IMM’er af mus9 og Drosophila væv9. Andre laboratorier bruger nu rutinemæssigt denne teknik til at studere de biofysiske egenskaber ved MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM-plasterklemmeanalyse af kalium- og kloridkonduktans er også mulig og er blevet nævnt i flere artikler, men har endnu ikke været hovedemnet for en publikation 6,7,9. Den første måling af H+-strømme på tværs af IMM blev rapporteret i 2012 fra musebrune fedtmitokondrier6 og fra muse-beige fedtmitokondrier i 20177. Denne strøm skyldes det specifikke afkoblingsprotein af termogene væv, UCP1 6,7. Nyligt arbejde offentliggjort i 2019 karakteriserede AAC som det vigtigste protein, der er ansvarligt for mitokondriel H + –lækage i ikke-fedtvæv som hjerte- og skeletmuskulatur5.
Denne unikke tilgang giver nu mulighed for direkte højopløselig funktionel analyse af mitokondrielle ionkanaler og transportører, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese. For at lette udvidelsen af metoden og supplere andre undersøgelser såsom mitokondriel respiration er der beskrevet en detaljeret protokol nedenfor til måling af H + – strømme, der bæres af UCP1 og AAC. Tre vigtige trin er beskrevet: 1) mitokondriel isolering fra musebrunt fedt for at analysere UCP1-afhængig H + -strøm og mitokondriel isolering fra hjertet for at analysere AAC-afhængig H + -strøm, 2) forberedelse af mitoplaster med en fransk presse til mekanisk brud på den ydre mitokondriemembran (OMM), 3) patch-clamp optagelser af UCP1 og AAC-afhængige H + strømme på tværs af hele IMM.
Denne metodeartikel har til formål at præsentere patch-clamp-teknikken, der for nylig blev anvendt på mitokondrier, en ny tilgang til direkte at studere H + lækage gennem IMM, der er ansvarlig for mitokondriel termogenese 5,6,7,15. Denne teknik er ikke begrænset til væv og kan også bruges til at analysere H + lækage og andre konduktanser af IMM i forskellige standa…
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr. Yuriy Kirichok for den store videnskab, jeg var en del af i hans laboratorium og medlemmerne af Kirichok-laboratoriet for de nyttige diskussioner. Jeg takker også Dr. Douglas C. Wallace for at levere AAC1 knockout-mus. Finansiering: A.M.B blev støttet af en American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
Faraday cage | Homemade | ||
French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
pClamp 10 | Molecular Devices | ||
Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
Chemicals | |||
D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |