Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen
Summary
Dit methodeartikel beschrijft de belangrijkste stappen in het meten van H + -lek over het binnenste mitochondriale membraan met de patch-clamp-techniek, een nieuwe benadering om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen.
Abstract
Mitochondriale thermogenese (ook bekend als mitochondriale ontkoppeling) is een van de meest veelbelovende doelen voor het verhogen van het energieverbruik om het metabool syndroom te bestrijden. Thermogene weefsels zoals bruine en beige vetten ontwikkelen zeer gespecialiseerde mitochondriën voor warmteproductie. Mitochondriën van andere weefsels, die voornamelijk ATP produceren, zetten ook tot 25% van de totale mitochondriale energieproductie om in warmte en kunnen daarom een aanzienlijke invloed hebben op de fysiologie van het hele lichaam. Mitochondriale thermogenese is niet alleen essentieel voor het handhaven van de lichaamstemperatuur, maar voorkomt ook door voeding veroorzaakte obesitas en vermindert de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade. Aangezien mitochondriale thermogenese een belangrijke regulator is van het cellulaire metabolisme, zal een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces helpen bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden. Belangrijk is dat de precieze moleculaire mechanismen die acute activering van thermogenese in mitochondriën regelen, slecht gedefinieerd zijn. Dit gebrek aan informatie is grotendeels te wijten aan een gebrek aan methoden voor de directe meting van ontkoppelende eiwitten. De recente ontwikkeling van patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën maakte voor het eerst de directe studie mogelijk van het fenomeen aan de oorsprong van mitochondriale thermogenese, H + lek door de IMM, en de eerste biofysische karakterisering van mitochondriale transporters die ervoor verantwoordelijk zijn, het ontkoppelende eiwit 1 (UCP1), specifiek van bruine en beige vetten, en de ADP / ATP-transporter (AAC) voor alle andere weefsels. Deze unieke aanpak zal nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die H + -lekkage en mitochondriale thermogenese beheersen en hoe ze kunnen worden gericht op het bestrijden van het metabool syndroom. Dit artikel beschrijft de patch-clamp-methodologie die wordt toegepast op mitochondriën om hun thermogene capaciteit te bestuderen door H + – stromen rechtstreeks te meten via de IMM.
Introduction
Mitochondriën staan bekend als de krachtpatser van de cel. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste bron van chemische energie, ATP. Wat minder bekend is, is dat mitochondriën ook warmte genereren. In feite genereert elk mitochondrion constant de twee soorten energieën (ATP en warmte) en een fijne balans tussen de twee energievormen definieert metabole celhomeostase (figuur 1). Hoe mitochondriën energie verdelen tussen ATP en warmte is zeker de meest fundamentele vraag op het gebied van bio-energetica, hoewel het nog grotendeels onbekend is. We weten wel dat het verhogen van de mitochondriale warmteproductie (mitochondriale thermogenese genoemd) en bijgevolg het verminderen van de ATP-productie het energieverbruik verhoogt en dit is een van de beste manieren om het metabool syndroom te bestrijden1.
Mitochondriale thermogenese is afkomstig van H+ lek over het binnenste mitochondriale membraan (IMM), wat leidt tot ontkoppeling van substraatoxidatie en ATP-synthese met daaruit voortvloeiende productie van warmte, vandaar de naam “mitochondriale ontkoppeling”1 (figuur 1). Dit H+ lek is afhankelijk van mitochondriale transporters die ontkoppelende eiwitten (UCP’s) worden genoemd. UCP1 was het eerste UCP dat werd geïdentificeerd. Het wordt alleen uitgedrukt in thermogene weefsels, bruin vet en beige vet waarin mitochondriën gespecialiseerd zijn voor warmteproductie 2,3,4. De identiteit van UCP in niet-vetweefsels zoals skeletspieren, hart en lever is controversieel gebleven. Mitochondriën in deze weefsels kunnen ongeveer 25% van de totale mitochondriale energie omzetten in warmte, wat de fysiologie van het hele lichaam aanzienlijk kan beïnvloeden1. Naast het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam, voorkomt mitochondriale thermogenese ook door voeding veroorzaakte obesitas door calorieën te verminderen. Bovendien vermindert het de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) door mitochondriën om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade1. Mitochondriale thermogenese is dus betrokken bij normale veroudering, leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en andere aandoeningen met oxidatieve stress, zoals ischemie-reperfusie. Daarom is mitochondriale thermogenese een krachtige regulator van cellulair metabolisme, en een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces zal de ontwikkeling van therapeutische strategieën bevorderen om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden.
Mitochondriale ademhaling was de eerste techniek die de cruciale rol van mitochondriale thermogenese in het cellulaire metabolisme onthulde en is nog steeds de meest populaire in de gemeenschap1. Deze techniek is gebaseerd op het meten van het zuurstofverbruik door de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) die toeneemt wanneer mitochondriaal H+ lek wordt geactiveerd. Deze techniek, hoewel instrumenteel, kan mitochondriaal H + -lek over de IMM1 niet rechtstreeks bestuderen, waardoor de precieze identificatie en karakterisering van de eiwitten die ervoor verantwoordelijk zijn moeilijk wordt, met name in niet-vetweefsels waarin warmteproductie secundair is in vergelijking met ATP-productie. Onlangs leverde de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek toegepast op mitochondriën de eerste directe studie van H + -lek over het hele IMM in verschillende weefsels 5,6,7.
De mitochondriale patch-clamp van de hele IMM werd voor het eerst op een reproduceerbare manier vastgesteld door Kirichok et al.8. Ze beschreven de eerste directe meting van mitochondriale calcium uniporter (MCU) stromen in 2004 met behulp van mitoplasten uit COS-7 cellijnen8. Later toonde het Kirichok-lab calciumstromen van IMMS van muis9– en Drosophila-weefsels 9. Andere laboratoria gebruiken deze techniek nu routinematig om de biofysische eigenschappen van MCU 10,11,12,13,14 te bestuderen. Hele IMM patch-clamp analyse van kalium- en chloridegeleiding is ook mogelijk en is genoemd in verschillende artikelen, maar is nog niet het hoofdonderwerp geweest van een publicatie 6,7,9. De eerste meting van H + -stromen over de IMM werd gerapporteerd in 2012 van muisbruine vet mitochondriën6 en van muisbeige vet mitochondriën in 20177. Deze stroom is te wijten aan het specifieke ontkoppelingseiwit van thermogene weefsels, UCP1 6,7. Recent werk gepubliceerd in 2019 karakteriseerde OC als het belangrijkste eiwit dat verantwoordelijk is voor mitochondriaal H + -lek in niet-vetweefsels zoals het hart en de skeletspieren5.
Deze unieke aanpak maakt nu de directe hoge-resolutie functionele analyse mogelijk van de mitochondriale ionkanalen en transporters die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Om de uitbreiding van de methode te vergemakkelijken en andere studies zoals mitochondriale ademhaling aan te vullen, wordt hieronder een gedetailleerd protocol beschreven voor het meten van de H + -stromen die door UCP1 en AAC worden gedragen. Drie belangrijke stappen worden beschreven: 1) mitochondriale isolatie van muisbruin vet om UCP1-afhankelijke H + -stroom en mitochondriale isolatie van het hart te analyseren om AAC-afhankelijke H + -stroom te analyseren, 2) voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van het buitenste mitochondriale membraan (OMM), 3) patch-clamp-opnames van UCP1- en AAC-afhankelijke H + -stromen over de hele IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit methodeartikel heeft tot doel de patch-clamp-techniek te presenteren die onlangs is toegepast op mitochondriën, een nieuwe benadering om H + -lek rechtstreeks te bestuderen via de IMM die verantwoordelijk is voor mitochondriale thermogenese 5,6,7,15. Deze techniek is niet beperkt tot weefsels en kan ook worden gebruikt om H + -lekken en andere geleidingen van de IMM t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank Dr. Yuriy Kirichok voor de grote wetenschap waar ik deel van uitmaakte in zijn lab en de leden van het Kirichok lab voor de nuttige discussies. Ik dank ook Dr. Douglas C. Wallace voor het verstrekken van AAC1 knock-out muizen. Financiering: A.M.B werd ondersteund door een American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
