L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries
Summary
Cet article sur la méthode détaille les principales étapes de la mesure de la fuite H+ à travers la membrane mitochondriale interne avec la technique patch-clamp, une nouvelle approche pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries.
Abstract
La thermogenèse mitochondriale (également connue sous le nom de découplage mitochondrial) est l’une des cibles les plus prometteuses pour augmenter la dépense énergétique afin de lutter contre le syndrome métabolique. Les tissus thermogéniques tels que les graisses brunes et beiges développent des mitochondries hautement spécialisées pour la production de chaleur. Les mitochondries d’autres tissus, qui produisent principalement de l’ATP, convertissent également jusqu’à 25% de la production totale d’énergie mitochondriale en chaleur et peuvent donc avoir un impact considérable sur la physiologie de tout le corps. La thermogenèse mitochondriale est non seulement essentielle pour maintenir la température corporelle, mais prévient également l’obésité induite par l’alimentation et réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pour protéger les cellules des dommages oxydatifs. Étant donné que la thermogenèse mitochondriale est un régulateur clé du métabolisme cellulaire, une compréhension mécaniste de ce processus fondamental aidera au développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial. Il est important de noter que les mécanismes moléculaires précis qui contrôlent l’activation aiguë de la thermogenèse dans les mitochondries sont mal définis. Ce manque d’information est en grande partie dû à une pénurie de méthodes pour la mesure directe des protéines de découplage. Le développement récent de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a permis, pour la première fois, l’étude directe du phénomène à l’origine de la thermogenèse mitochondriale, de la fuite H+ à travers l’IMM, et de la première caractérisation biophysique des transporteurs mitochondriaux qui en sont responsables, la protéine de découplage 1 (UCP1), spécifique des graisses brunes et beiges, et le transporteur ADP/ATP (AAC) pour tous les autres tissus. Cette approche unique fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent les fuites H+ et la thermogenèse mitochondriale et sur la façon dont ils peuvent être ciblés pour lutter contre le syndrome métabolique. Cet article décrit la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries pour étudier leur capacité thermogénique en mesurant directement les courants H+ à travers l’IMM.
Introduction
Les mitochondries sont célèbres pour être la centrale électrique de la cellule. En effet, ils sont la principale source d’énergie chimique, l’ATP. Ce que l’on sait moins, c’est que les mitochondries génèrent également de la chaleur. En fait, chaque mitochondrie génère constamment les deux types d’énergies (ATP et chaleur) et un équilibre fin entre les deux formes d’énergie définit l’homéostasie cellulaire métabolique (Figure 1). Comment les mitochondries distribuent l’énergie entre l’ATP et la chaleur est certainement la question la plus fondamentale dans le domaine de la bioénergétique, bien qu’elle soit encore largement inconnue. Nous savons que l’augmentation de la production de chaleur mitochondriale (appelée thermogenèse mitochondriale) et, par conséquent, la réduction de la production d’ATP augmentent la dépense énergétique et c’est l’un des meilleurs moyens de lutter contre le syndrome métabolique1.
La thermogenèse mitochondriale provient d’une fuite de H+ à travers la membrane mitochondriale interne (IMM), conduisant au découplage de l’oxydation du substrat et de la synthèse de l’ATP avec la production conséquente de chaleur, d’où le nom de « découplage mitochondrial »1 (Figure 1). Cette fuite H+ dépend de transporteurs mitochondriaux appelés protéines de découplage (UCP). UCP1 a été le premier UCP identifié. Il n’est exprimé que dans les tissus thermogéniques, la graisse brune et la graisse beige dans lesquels les mitochondries sont spécialisées pour la production de chaleur 2,3,4. L’identité de l’UCP dans les tissus non adipeux tels que les muscles squelettiques, le cœur et le foie est restée controversée. Les mitochondries dans ces tissus peuvent avoir environ 25% de l’énergie mitochondriale totale convertie en chaleur, ce qui peut avoir un impact significatif sur la physiologie de tout le corps1. En plus de maintenir la température corporelle centrale, la thermogenèse mitochondriale prévient également l’obésité induite par l’alimentation en réduisant les calories. De plus, il réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mitochondries pour protéger les cellules des dommages oxydatifs1. Ainsi, la thermogenèse mitochondriale est impliquée dans le vieillissement normal, les troubles dégénératifs liés à l’âge et d’autres conditions impliquant un stress oxydatif, telles que l’ischémie-reperfusion. Par conséquent, la thermogenèse mitochondriale est un puissant régulateur du métabolisme cellulaire, et une compréhension mécaniste de ce processus fondamental favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial.
La respiration mitochondriale a été la première technique à révéler le rôle crucial de la thermogenèse mitochondriale dans le métabolisme cellulaire et reste la plus populaire dans la communauté1. Cette technique est basée sur la mesure de la consommation d’oxygène par la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) qui augmente lorsque la fuite mitochondriale H+ est activée. Cette technique, bien qu’instrumentale, ne peut pas étudier directement la fuite mitochondriale H+ à travers l’IMM1, ce qui rend difficile l’identification et la caractérisation précises des protéines qui en sont responsables, en particulier dans les tissus non adipeux dans lesquels la production de chaleur est secondaire par rapport à la production d’ATP. Récemment, le développement de la technique patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H+ sur l’ensemble de l’IMM dans divers tissus 5,6,7.
Le patch-clamp mitochondrial de l’ensemble de l’IMM a été établi pour la première fois de manière reproductible par Kirichok et al.8. Ils ont décrit la première mesure directe des courants mitochondriaux d’uniporteur de calcium (MCU) en 2004 à l’aide de mitoplastes des lignées cellulaires COS-78. Plus tard, le laboratoire Kirichok a montré les courants de calcium des IMM de souris9 et des tissus de la drosophile 9. D’autres laboratoires utilisent maintenant régulièrement cette technique pour étudier les propriétés biophysiques du MICROCONTRÔLEUR 10,11,12,13,14. L’analyse complète de la conductance du potassium et du chlorure par patch-clamp IMM est également possible et a été mentionnée dans plusieurs articles, mais n’a pas encore fait l’objet principal d’une publication 6,7,9. La première mesure des courants H+ à travers l’IMM a été rapportée en 2012 à partir de mitochondries de graisse brunede souris 6, et de mitochondries de graisse beige de souris en 20177. Ce courant est dû à la protéine de découplage spécifique des tissus thermogéniques, UCP1 6,7. Des travaux récents publiés en 2019 ont caractérisé la CAA comme la principale protéine responsable de la fuite mitochondriale de H+ dans les tissus non adipeux tels que le cœur et le muscle squelettique5.
Cette approche unique permet maintenant l’analyse fonctionnelle directe à haute résolution des canaux ioniques mitochondriaux et des transporteurs responsables de la thermogenèse mitochondriale. Pour faciliter l’expansion de la méthode et compléter d’autres études telles que la respiration mitochondriale, un protocole détaillé est décrit ci-dessous pour mesurer les courants H+ transportés par UCP1 et AAC. Trois étapes importantes sont décrites : 1) isolement mitochondrial de la graisse brune de souris pour analyser le courant H+ dépendant de l’UCP1 et isolement mitochondrial du cœur pour analyser le courant H+ dépendant de l’AAC, 2) préparation des mitoplastes avec une Français Pression pour la rupture mécanique de la membrane mitochondriale externe (OMM), 3) enregistrements patch-clamp des courants UCP1 et AAC-dépendants H+ sur l’ensemble de l’IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article sur la méthode vise à présenter la technique patch-clamp récemment appliquée aux mitochondries, une nouvelle approche pour étudier directement la fuite H+ à travers l’IMM responsable de la thermogenèse mitochondriale 5,6,7,15. Cette technique ne se limite pas aux tissus et peut également être utilisée pour analyser les fuites H+ et d’autres condu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Je remercie le Dr Yuriy Kirichok pour la grande science dont j’ai fait partie dans son laboratoire et les membres du laboratoire Kirichok pour les discussions utiles. Je remercie également le Dr Douglas C. Wallace d’avoir fourni des souris knockout AAC1 . Financement : A.M.B a reçu un prix de développement de carrière de l’American Heart Association 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
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