माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग
Summary
यह विधि लेख पैच-क्लैंप तकनीक के साथ आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एच + रिसाव को मापने में मुख्य चरणों का विवरण देता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग के रूप में भी जाना जाता है) चयापचय सिंड्रोम से निपटने के लिए ऊर्जा व्यय बढ़ाने के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक है। थर्मोजेनिक ऊतक जैसे भूरे और बेज वसा गर्मी उत्पादन के लिए अत्यधिक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया विकसित करते हैं। अन्य ऊतकों के माइटोकॉन्ड्रिया, जो मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करते हैं, कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा उत्पादन के 25% तक गर्मी में परिवर्तित होते हैं और इसलिए, पूरे शरीर के शरीर विज्ञान पर काफी प्रभाव डाल सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस न केवल शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, बल्कि आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है और कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करता है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक प्रमुख नियामक है, इसलिए इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद करेगी। महत्वपूर्ण रूप से, सटीक आणविक तंत्र जो माइटोकॉन्ड्रिया में थर्मोजेनेसिस के तीव्र सक्रियण को नियंत्रित करते हैं, खराब रूप से परिभाषित हैं। जानकारी की यह कमी काफी हद तक अनकपलिंग प्रोटीन के प्रत्यक्ष माप के तरीकों की कमी के कारण है। माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति के हालिया विकास ने पहली बार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की उत्पत्ति पर घटना का प्रत्यक्ष अध्ययन, आईएमएम के माध्यम से एच + रिसाव, और इसके लिए जिम्मेदार माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टरों का पहला बायोफिजिकल लक्षण वर्णन सक्षम किया, अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1), भूरे और बेज वसा के विशिष्ट, और अन्य सभी ऊतकों के लिए एडीपी / यह अनूठा दृष्टिकोण एच + रिसाव और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले तंत्रों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और चयापचय सिंड्रोम का मुकाबला करने के लिए उन्हें कैसे लक्षित किया जा सकता है। यह पेपर आईएमएम के माध्यम से एच + धाराओं को सीधे मापकर उनकी थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति का वर्णन करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया सेल का पावरहाउस होने के लिए प्रसिद्ध हैं। दरअसल, वे रासायनिक ऊर्जा, एटीपी का प्रमुख स्रोत हैं। क्या कम ज्ञात है कि माइटोकॉन्ड्रिया भी गर्मी उत्पन्न करता है। वास्तव में, प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन लगातार दो प्रकार की ऊर्जा (एटीपी और गर्मी) उत्पन्न करता है और दो ऊर्जा रूपों के बीच एक अच्छा संतुलन चयापचय सेल होमियोस्टेसिस (चित्रा 1) को परिभाषित करता है। एटीपी और गर्मी के बीच माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा कैसे वितरित करता है, यह निश्चित रूप से बायोएनर्जेटिक्स के क्षेत्र में सबसे मौलिक प्रश्न है, हालांकि यह अभी भी काफी हद तक अज्ञात है। हम जानते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल गर्मी उत्पादन (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कहा जाता है) में वृद्धि, और इसके परिणामस्वरूप एटीपी उत्पादन को कम करने से ऊर्जा व्यय बढ़ जाता है और यह चयापचय सिंड्रोम1 से निपटने के सर्वोत्तम तरीकों में से एक है।
माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) में एच + रिसाव से उत्पन्न होता है, जिससे गर्मी के परिणामी उत्पादन के साथ सब्सट्रेट ऑक्सीकरण और एटीपी संश्लेषण का विघटन होता है, इसलिए नाम “माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग” 1 (चित्रा 1)। यह एच + रिसाव माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टर्स पर निर्भर करता है जिसे अनकपलिंग प्रोटीन (यूसीपी) कहा जाता है। यूसीपी 1 पहचाना गया पहला यूसीपी था। यह केवल थर्मोजेनिक ऊतकों, भूरे रंग की वसा और बेज वसा में व्यक्त किया जाता है जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया गर्मी उत्पादन 2,3,4 के लिए विशिष्ट होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों, हृदय और यकृत जैसे गैर-वसा ऊतकों में यूसीपी की पहचान विवादास्पद बनी हुई है। इन ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया में गर्मी में परिवर्तित कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा का लगभग 25% हो सकता है, जो पूरे शरीर के शरीर विज्ञान को काफी प्रभावित कर सकताहै 1. कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कैलोरी को कम करके आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है। इसके अलावा, यह कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करताहै 1. इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सामान्य उम्र बढ़ने, उम्र से संबंधित अपक्षयी विकारों और ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ी अन्य स्थितियों में शामिल है, जैसे कि इस्किमिया-रीपरफ्यूजन। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक शक्तिशाली नियामक है, और इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को बढ़ावा देगी।
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सेलुलर चयापचय में माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की महत्वपूर्ण भूमिका को प्रकट करने वाली पहली तकनीक थी और अभी भी समुदाय1 में सबसे लोकप्रिय है। यह तकनीक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) द्वारा ऑक्सीजन की खपत के माप पर आधारित है जो माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव सक्रिय होने पर बढ़ जाती है। यह तकनीक, हालांकि वाद्य, सीधे आईएमएम1 में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव का अध्ययन नहीं कर सकती है, जिससे इसके लिए जिम्मेदार प्रोटीन की सटीक पहचान और लक्षण वर्णन मुश्किल हो जाता है, खासकर गैर-वसा ऊतकों में जिसमें एटीपी उत्पादन की तुलना में गर्मी उत्पादन माध्यमिक होता है। हाल ही में, माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक के विकास ने विभिन्न ऊतकों 5,6,7 में पूरे आईएमएम में एच + रिसाव का पहला प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान किया।
पूरे आईएमएम के माइटोकॉन्ड्रियल पैच-क्लैंप को पहली बार किरिचोक एट अल द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से स्थापित किया गया था। उन्होंने सीओएस -7 सेल लाइनों 8 से मिटोप्लास्ट का उपयोग करके 2004 में माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम यूनिपोर्टर (एमसीयू) धाराओं के पहले प्रत्यक्ष माप का वर्णनकिया। बाद में, किरिचोक प्रयोगशाला ने माउस9 और ड्रोसोफिला ऊतकों9 के आईएमएम से कैल्शियम धाराओं को दिखाया। अन्य प्रयोगशालाएं अब नियमित रूप से एमसीयू10,11,12,13,14 के बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करती हैं। पोटेशियम और क्लोराइड आचरण का पूरा आईएमएम पैच-क्लैंप विश्लेषण भी संभव है और कई पत्रों में उल्लेख किया गया है लेकिन अभी तक प्रकाशन 6,7,9 का मुख्य विषय नहीं रहा है। आईएमएम में एच + धाराओं का पहला माप 2012 में माउस ब्राउन वसा माइटोकॉन्ड्रिया6 से और 20177 में माउस बेज वसा माइटोकॉन्ड्रिया से रिपोर्ट किया गया था। यह वर्तमान थर्मोजेनिक ऊतकों, यूसीपी 1 6,7 के विशिष्ट अनकपलिंग प्रोटीन के कारण है। 2019 में प्रकाशित हालिया काम ने एएसी को दिल और कंकाल की मांसपेशियों जैसे गैर-वसा ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव के लिए जिम्मेदार मुख्य प्रोटीन के रूप में वर्णितकिया।
यह अनूठा दृष्टिकोण अब माइटोकॉन्ड्रियल आयन चैनलों और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों के प्रत्यक्ष उच्च-रिज़ॉल्यूशन कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि के विस्तार को सुविधाजनक बनाने के लिए और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जैसे अन्य अध्ययनों के पूरक के लिए, यूसीपी 1 और एएसी द्वारा किए गए एच + धाराओं को मापने के लिए नीचे एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन किया गया है: 1) माउस ब्राउन वसा से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव एएसी-निर्भर एच + वर्तमान का विश्लेषण करने के लिए दिल से यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का विश्लेषण करने के लिए, 2) बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) के यांत्रिक टूटने के लिए फ्रांसीसी प्रेस के साथ मिटोप्लास्ट की तैयारी, 3) पूरे आईएमएम में यूसीपी 1 और एएसी-निर्भर एच + धाराओं की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि लेख का उद्देश्य हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक को प्रस्तुत करना है, जो माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस 5,6,7,15 के लिए जिम्मेदार आईएमएम के माध्यम ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यूरी किरिचोक को उस महान विज्ञान के लिए धन्यवाद देता हूं जिसका मैं अपनी प्रयोगशाला में हिस्सा था और सहायक चर्चाओं के लिए किरिचोक प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं। मैं एएसी 1 नॉकआउट चूहों को प्रदान करने के लिए डॉ डगलस सी वालेस को भी धन्यवाद देता हूं। फंडिंग: एएमबी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड 19सीडीए 34630062 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
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