L'uso della tecnica Patch-Clamp per studiare la capacità termogenica dei mitocondri
Summary
Questo articolo sul metodo descrive in dettaglio i passaggi principali nella misurazione della perdita di H + attraverso la membrana mitocondriale interna con la tecnica patch-clamp, un nuovo approccio per studiare la capacità termogenica dei mitocondri.
Abstract
La termogenesi mitocondriale (nota anche come disaccoppiamento mitocondriale) è uno degli obiettivi più promettenti per aumentare il dispendio energetico per combattere la sindrome metabolica. I tessuti termogenici come i grassi marroni e beige sviluppano mitocondri altamente specializzati per la produzione di calore. Anche i mitocondri di altri tessuti, che producono principalmente ATP, convertono fino al 25% della produzione totale di energia mitocondriale in calore e possono, quindi, avere un impatto considerevole sulla fisiologia di tutto il corpo. La termogenesi mitocondriale non è solo essenziale per mantenere la temperatura corporea, ma previene anche l’obesità indotta dalla dieta e riduce la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) per proteggere le cellule dal danno ossidativo. Poiché la termogenesi mitocondriale è un regolatore chiave del metabolismo cellulare, una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale aiuterà nello sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale. È importante sottolineare che i precisi meccanismi molecolari che controllano l’attivazione acuta della termogenesi nei mitocondri sono scarsamente definiti. Questa mancanza di informazioni è in gran parte dovuta alla scarsità di metodi per la misurazione diretta delle proteine disaccoppiate. Il recente sviluppo della metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri ha permesso, per la prima volta, lo studio diretto del fenomeno all’origine della termogenesi mitocondriale, la fuoriuscita di H+ attraverso l’IMM, e la prima caratterizzazione biofisica dei trasportatori mitocondriali responsabili di esso, la proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1), specifica dei grassi bruni e beige, e il trasportatore ADP/ATP (AAC) per tutti gli altri tessuti. Questo approccio unico fornirà nuove informazioni sui meccanismi che controllano la perdita di H + e la termogenesi mitocondriale e su come possono essere mirati a combattere la sindrome metabolica. Questo articolo descrive la metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri per studiare la loro capacità termogenica misurando direttamente le correnti H + attraverso l’IMM.
Introduction
I mitocondri sono famosi per essere la centrale elettrica della cellula. In effetti, sono la principale fonte di energia chimica, l’ATP. Ciò che è meno noto è che anche i mitocondri generano calore. Infatti, ogni mitocondrio genera costantemente i due tipi di energie (ATP e calore) e un sottile equilibrio tra le due forme energetiche definisce l’omeostasi cellulare metabolica (Figura 1). Come i mitocondri distribuiscano energia tra ATP e calore è sicuramente la questione più fondamentale nel campo della bioenergetica, anche se è ancora in gran parte sconosciuta. Sappiamo che aumentare la produzione di calore mitocondriale (chiamata termogenesi mitocondriale) e di conseguenza ridurre la produzione di ATP aumenta il dispendio energetico e questo è uno dei modi migliori per combattere la sindrome metabolica1.
La termogenesi mitocondriale ha origine dalla perdita di H+ attraverso la membrana mitocondriale interna (IMM), che porta al disaccoppiamento dell’ossidazione del substrato e alla sintesi di ATP con conseguente produzione di calore, da cui il nome “disaccoppiamento mitocondriale”1 (Figura 1). Questa perdita di H + dipende dai trasportatori mitocondriali chiamati proteine di disaccoppiamento (UCP). UCP1 è stato il primo UCP identificato. È espresso solo in tessuti termogenici, grasso bruno e grasso beige in cui i mitocondri sono specializzati per la produzione di calore 2,3,4. L’identità di UCP nei tessuti non adiposi come il muscolo scheletrico, il cuore e il fegato, è rimasta controversa. I mitocondri in questi tessuti possono avere circa il 25% dell’energia mitocondriale totale convertita in calore, che può avere un impatto significativo sulla fisiologia di tutto il corpo1. Oltre a mantenere la temperatura corporea interna, la termogenesi mitocondriale previene anche l’obesità indotta dalla dieta riducendo le calorie. Inoltre, riduce la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) da parte dei mitocondri per proteggere le cellule dal danno ossidativo1. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è coinvolta nel normale invecchiamento, nei disturbi degenerativi legati all’età e in altre condizioni che coinvolgono lo stress ossidativo, come l’ischemia-riperfusione. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è un potente regolatore del metabolismo cellulare e una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale promuoverà lo sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale.
La respirazione mitocondriale è stata la prima tecnica a rivelare il ruolo cruciale della termogenesi mitocondriale nel metabolismo cellulare ed è ancora la più popolare nella comunità1. Questa tecnica si basa sulla misurazione del consumo di ossigeno da parte della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) che aumenta quando viene attivata la perdita mitocondriale di H+. Questa tecnica, sebbene strumentale, non può studiare direttamente la perdita mitocondriale di H+ attraverso l’IMM1, rendendo così difficile l’identificazione e la caratterizzazione precisa delle proteine responsabili, in particolare nei tessuti non adiposi in cui la produzione di calore è secondaria rispetto alla produzione di ATP. Recentemente, lo sviluppo della tecnica patch-clamp applicata ai mitocondri, ha fornito il primo studio diretto della perdita di H+ attraverso l’intero IMM in vari tessuti 5,6,7.
Il patch-clamp mitocondriale dell’intero IMM è stato stabilito per la prima volta in modo riproducibile da Kirichok et al.8. Hanno descritto la prima misurazione diretta delle correnti dell’uniporter di calcio mitocondriale (MCU) nel 2004 utilizzando mitoplasti delle linee cellulari COS-78. Più tardi, il laboratorio kirichok ha mostrato correnti di calcio da IMM dei tessuti di topo9 e Drosophila 9. Altri laboratori ora usano abitualmente questa tecnica per studiare le proprietà biofisiche di MCU 10,11,12,13,14. È anche possibile l’analisi intera del patch-clamp IMM della conduttanza di potassio e cloruro ed è stata menzionata in diversi articoli, ma non è ancora stata l’oggetto principale di una pubblicazione 6,7,9. La prima misurazione delle correnti H + attraverso l’IMM è stata riportata nel 2012 dai mitocondri di grasso bruno del topo6 e dai mitocondri di grasso beige del topo nel 20177. Questa corrente è dovuta alla specifica proteina di disaccoppiamento dei tessuti termogenici, UCP1 6,7. Recenti lavori pubblicati nel 2019 hanno caratterizzato l’AAC come la principale proteina responsabile della perdita di H+ mitocondriale nei tessuti non adiposi come il cuore e il muscolo scheletrico5.
Questo approccio unico consente ora l’analisi funzionale diretta ad alta risoluzione dei canali ionici mitocondriali e dei trasportatori responsabili della termogenesi mitocondriale. Per facilitare l’espansione del metodo e per integrare altri studi come la respirazione mitocondriale, di seguito viene descritto un protocollo dettagliato per misurare le correnti H + trasportate da UCP1 e AAC. Vengono descritti tre passaggi importanti: 1) isolamento mitocondriale dal grasso bruno del topo per analizzare la corrente H+ dipendente da UCP1 e l’isolamento mitocondriale dal cuore per analizzare la corrente H+ dipendente da AAC, 2) preparazione di mitoplasti con una pressa francese per la rottura meccanica della membrana mitocondriale esterna (OMM), 3) registrazioni patch-clamp di correnti H+ UCP1 e AAC-dipendenti su tutto l’IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo sul metodo si propone di presentare la tecnica patch-clamp recentemente applicata ai mitocondri, un nuovo approccio per studiare direttamente la perdita di H+ attraverso l’IMM responsabile della termogenesi mitocondriale 5,6,7,15. Questa tecnica non è limitata ai tessuti e può anche essere utilizzata per analizzare la perdita di H + e altre conduttanze de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringrazio il Dr. Yuriy Kirichok per la grande scienza di cui ho fatto parte nel suo laboratorio e i membri del laboratorio Kirichok per le utili discussioni. Ringrazio anche il Dr. Douglas C. Wallace per aver fornito topi knockout AAC1 . Finanziamento: A.M.B è stato supportato da un American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
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