Denne metodeartikkelen beskriver hovedtrinnene for å måle H + lekkasje over den indre mitokondriemembranen med patch-clamp-teknikken, en ny tilnærming for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier.
Mitokondrietermogenese (også kjent som mitokondrie-frakobling) er et av de mest lovende målene for å øke energiforbruket for å bekjempe metabolsk syndrom. Termogene vev som brunt og beige fett utvikler svært spesialiserte mitokondrier for varmeproduksjon. Mitokondrier av andre vev, som primært produserer ATP, konverterer også opptil 25% av den totale mitokondrieenergiproduksjonen til varme og kan derfor ha en betydelig innvirkning på fysiologien til hele kroppen. Mitokondrietermogenese er ikke bare viktig for å opprettholde kroppstemperaturen, men forhindrer også diettindusert fedme og reduserer produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) for å beskytte celler mot oksidativ skade. Siden mitokondrietermogenese er en nøkkelregulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen hjelpe i utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon. Det er viktig at de presise molekylære mekanismene som styrer akutt aktivering av termogenese i mitokondrier er dårlig definert. Denne mangelen på informasjon skyldes i stor grad en rekke metoder for direkte måling av frakobling av proteiner. Den nylige utviklingen av patch-clamp metodikk anvendt på mitokondrier aktivert, for første gang, den direkte studien av fenomenet ved opprinnelsen til mitokondrie termogenese, H + lekkasje gjennom IMM, og den første biofysiske karakteriseringen av mitokondrietransportører som er ansvarlige for det, det frakoblingsprotein 1 (UCP1), spesifikk for brune og beige fettstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre vev. Denne unike tilnærmingen vil gi ny innsikt i mekanismene som styrer H + lekkasje og mitokondrie termogenese og hvordan de kan målrettes mot å bekjempe metabolsk syndrom. Dette dokumentet beskriver patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier for å studere deres termogene kapasitet ved å måle H + strømmer direkte gjennom IMM.
Mitokondrier er kjent for å være cellens kraftstasjon. Faktisk er de den viktigste kilden til kjemisk energi, ATP. Det som er mindre kjent er at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokon hele tiden de to energitypene (ATP og varme) og en fin balanse mellom de to energiformene definerer metabolsk celle homeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier distribuerer energi mellom ATP og varme er absolutt det mest grunnleggende spørsmålet innen bioenergetikk, selv om det fortsatt i stor grad er ukjent. Vi vet at økende mitokondrievarmeproduksjon (kalt mitokondrietermogenese), og dermed redusere ATP-produksjonen øker energiforbruket, og dette er en av de beste måtene å bekjempe metabolsk syndrom1.
Mitokondrietermogenese stammer fra H+ lekkasje over den indre mitokondriemembranen (IMM), noe som fører til frakobling av substratoksidasjon og ATP-syntese med påfølgende varmeproduksjon, derav navnet “mitokondrie-frakobling”1 (figur 1). Denne H+ lekkasjen avhenger av mitokondrietransportører kalt frakoblingsproteiner (UCPer). UCP1 var den første UCP identifisert. Det uttrykkes bare i termogent vev, brunt fett og beige fett der mitokondrier er spesialisert for varmeproduksjon 2,3,4. Identiteten til UCP i ikke-fettvev som skjelettmuskulatur, hjerte og lever, har forblitt kontroversielt. Mitokondrier i disse vevene kan ha ca 25% av den totale mitokondrieenergien omdannet til varme, noe som kan påvirke fysiologien til hele kroppen1 betydelig. I tillegg til å opprettholde kroppstemperaturen, forhindrer mitokondrie termogenese også diettindusert fedme ved å redusere kalorier. I tillegg reduserer det produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) av mitokondrier for å beskytte celler mot oksidativ skade1. Dermed er mitokondrietermogenese involvert i normal aldring, aldersrelaterte degenerative lidelser og andre forhold som involverer oksidativt stress, som iskemi-reperfusjon. Derfor er mitokondrietermogenese en kraftig regulator av cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen vil fremme utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon.
Mitokondrie respirasjon var den første teknikken for å avsløre den avgjørende rollen av mitokondrie termogenese i cellulær metabolisme og er fortsatt den mest populære i samfunnet1. Denne teknikken er basert på måling av oksygenforbruk av mitokondrie-elektrontransportkjeden (ETC) som øker når mitokondrie H + lekkasje aktiveres. Denne teknikken, selv om den er instrumentell, kan ikke direkte studere mitokondrie H + lekkasje over IMM1, og dermed gjøre presis identifisering og karakterisering av proteinene som er ansvarlige for det vanskelig, spesielt i ikke-fettvev der varmeproduksjonen er sekundær sammenlignet med ATP-produksjon. Nylig ga utviklingen av patch-clamp-teknikken som brukes på mitokondrier, den første direkte studien av H + lekkasje over hele IMM i ulike vev 5,6,7.
Mitokondrie patch-klemmen til hele IMM ble først etablert på en reproduserbar måte av Kirichok et al.8. De beskrev den første direkte målingen av mitokondriekalsium uniporter (MCU) strømmer i 2004 ved hjelp av mitoplaster fra COS-7 cellelinjer8. Senere viste Kirichok-laboratoriet kalsiumstrømmer fra IMMer av mus9 og Drosophila vev9. Andre laboratorier bruker nå rutinemessig denne teknikken til å studere de biofysiske egenskapene til MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM patch-clamp analyse av kalium og kloridledning er også mulig og har blitt nevnt i flere papirer, men har ennå ikke vært hovedtema for en publikasjon 6,7,9. Den første målingen av H + strømmer over IMM ble rapportert i 2012 fra musbrun fett mitokondrier6, og fra mus beige fett mitokondrier i 20177. Denne strømmen skyldes det spesifikke frakoblingsproteinet av termogent vev, UCP1 6,7. Nyere arbeid publisert i 2019 karakteriserte AAC som det viktigste proteinet som er ansvarlig for mitokondrie H + lekkasje i ikke-fettvev som hjerte og skjelettmuskulatur5.
Denne unike tilnærmingen gir nå mulighet for direkte høyoppløselig funksjonell analyse av mitokondrieionkanaler og transportører som er ansvarlige for mitokondrietermogenese. For å lette utvidelsen av metoden og for å utfylle andre studier som mitokondrie-respirasjon, er en detaljert protokoll beskrevet nedenfor for måling av H + strømninger som bæres av UCP1 og AAC. Tre viktige trinn er beskrevet: 1) mitokondrieisolasjon fra musbrunt fett for å analysere UCP1-avhengig H + strøm og mitokondrieisolasjon fra hjertet for å analysere AAC-avhengig H + strøm, 2) tilberedning av mitoplaster med en fransk presse for mekanisk brudd på den ytre mitokondriemembranen (OMM), 3) patch-klemmeopptak av UCP1 og AAC-avhengige H + strømmer over hele IMM.
Denne metodeartikkelen tar sikte på å presentere patch-clamp teknikken som nylig ble brukt på mitokondrier, en ny tilnærming for å direkte studere H + lekkasje gjennom IMM ansvarlig for mitokondrie termogenese 5,6,7,15. Denne teknikken er ikke begrenset til vev og kan også brukes til å analysere H + lekkasje og andre ledninger av IMM i forskjellige standard menneske…
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr. Yuriy Kirichok for den store vitenskapen jeg var en del av i laboratoriet hans og medlemmene av Kirichok-laboratoriet for de nyttige diskusjonene. Jeg takker også Dr. Douglas C. Wallace for å ha gitt AAC1 knockout mus. Finansiering: A.M.B ble støttet av American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
Faraday cage | Homemade | ||
French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
pClamp 10 | Molecular Devices | ||
Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
Chemicals | |||
D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |