Bruken av Patch-Clamp-teknikken for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier

Summary

Denne metodeartikkelen beskriver hovedtrinnene for å måle H ⁺ lekkasje over den indre mitokondriemembranen med patch-clamp-teknikken, en ny tilnærming for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier.

Abstract

Mitokondrietermogenese (også kjent som mitokondrie-frakobling) er et av de mest lovende målene for å øke energiforbruket for å bekjempe metabolsk syndrom. Termogene vev som brunt og beige fett utvikler svært spesialiserte mitokondrier for varmeproduksjon. Mitokondrier av andre vev, som primært produserer ATP, konverterer også opptil 25% av den totale mitokondrieenergiproduksjonen til varme og kan derfor ha en betydelig innvirkning på fysiologien til hele kroppen. Mitokondrietermogenese er ikke bare viktig for å opprettholde kroppstemperaturen, men forhindrer også diettindusert fedme og reduserer produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) for å beskytte celler mot oksidativ skade. Siden mitokondrietermogenese er en nøkkelregulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen hjelpe i utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon. Det er viktig at de presise molekylære mekanismene som styrer akutt aktivering av termogenese i mitokondrier er dårlig definert. Denne mangelen på informasjon skyldes i stor grad en rekke metoder for direkte måling av frakobling av proteiner. Den nylige utviklingen av patch-clamp metodikk anvendt på mitokondrier aktivert, for første gang, den direkte studien av fenomenet ved opprinnelsen til mitokondrie termogenese, H ⁺ lekkasje gjennom IMM, og den første biofysiske karakteriseringen av mitokondrietransportører som er ansvarlige for det, det frakoblingsprotein 1 (UCP1), spesifikk for brune og beige fettstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre vev. Denne unike tilnærmingen vil gi ny innsikt i mekanismene som styrer H ⁺ lekkasje og mitokondrie termogenese og hvordan de kan målrettes mot å bekjempe metabolsk syndrom. Dette dokumentet beskriver patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier for å studere deres termogene kapasitet ved å måle H ⁺ strømmer direkte gjennom IMM.

Introduction

Mitokondrier er kjent for å være cellens kraftstasjon. Faktisk er de den viktigste kilden til kjemisk energi, ATP. Det som er mindre kjent er at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokon hele tiden de to energitypene (ATP og varme) og en fin balanse mellom de to energiformene definerer metabolsk celle homeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier distribuerer energi mellom ATP og varme er absolutt det mest grunnleggende spørsmålet innen bioenergetikk, selv om det fortsatt i stor grad er ukjent. Vi vet at økende mitokondrievarmeproduksjon (kalt mitokondrietermogenese), og dermed redusere ATP-produksjonen øker energiforbruket, og dette er en av de beste måtene å bekjempe metabolsk syndrom¹.

Mitokondrietermogenese stammer fra H⁺ lekkasje over den indre mitokondriemembranen (IMM), noe som fører til frakobling av substratoksidasjon og ATP-syntese med påfølgende varmeproduksjon, derav navnet “mitokondrie-frakobling”¹ (figur 1). Denne H⁺ lekkasjen avhenger av mitokondrietransportører kalt frakoblingsproteiner (UCPer). UCP1 var den første UCP identifisert. Det uttrykkes bare i termogent vev, brunt fett og beige fett der mitokondrier er spesialisert for varmeproduksjon ^2,3,4. Identiteten til UCP i ikke-fettvev som skjelettmuskulatur, hjerte og lever, har forblitt kontroversielt. Mitokondrier i disse vevene kan ha ca 25% av den totale mitokondrieenergien omdannet til varme, noe som kan påvirke fysiologien til hele kroppen¹ betydelig. I tillegg til å opprettholde kroppstemperaturen, forhindrer mitokondrie termogenese også diettindusert fedme ved å redusere kalorier. I tillegg reduserer det produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) av mitokondrier for å beskytte celler mot oksidativ skade¹. Dermed er mitokondrietermogenese involvert i normal aldring, aldersrelaterte degenerative lidelser og andre forhold som involverer oksidativt stress, som iskemi-reperfusjon. Derfor er mitokondrietermogenese en kraftig regulator av cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen vil fremme utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon.

Mitokondrie respirasjon var den første teknikken for å avsløre den avgjørende rollen av mitokondrie termogenese i cellulær metabolisme og er fortsatt den mest populære i samfunnet¹. Denne teknikken er basert på måling av oksygenforbruk av mitokondrie-elektrontransportkjeden (ETC) som øker når mitokondrie H ⁺ lekkasje aktiveres. Denne teknikken, selv om den er instrumentell, kan ikke direkte studere mitokondrie H ⁺ lekkasje over IMM¹, og dermed gjøre presis identifisering og karakterisering av proteinene som er ansvarlige for det vanskelig, spesielt i ikke-fettvev der varmeproduksjonen er sekundær sammenlignet med ATP-produksjon. Nylig ga utviklingen av patch-clamp-teknikken som brukes på mitokondrier, den første direkte studien av H ⁺ lekkasje over hele IMM i ulike vev ^5,6,7.

Mitokondrie patch-klemmen til hele IMM ble først etablert på en reproduserbar måte av Kirichok et ^al.8. De beskrev den første direkte målingen av mitokondriekalsium uniporter (MCU) strømmer i 2004 ved hjelp av mitoplaster fra COS-7 cellelinjer⁸. Senere viste Kirichok-laboratoriet kalsiumstrømmer fra IMMer av mus⁹ og Drosophila vev⁹. Andre laboratorier bruker nå rutinemessig denne teknikken til å studere de biofysiske egenskapene til MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM patch-clamp analyse av kalium og kloridledning er også mulig og har blitt nevnt i flere papirer, men har ennå ikke vært hovedtema for en publikasjon ^6,7,9. Den første målingen av H ⁺ strømmer over IMM ble rapportert i 2012 fra musbrun fett mitokondrier⁶, og fra mus beige fett mitokondrier i 2017⁷. Denne strømmen skyldes det spesifikke frakoblingsproteinet av termogent vev, UCP1 ^6,7. Nyere arbeid publisert i 2019 karakteriserte AAC som det viktigste proteinet som er ansvarlig for mitokondrie H ⁺ lekkasje i ikke-fettvev som hjerte og skjelettmuskulatur⁵.

Denne unike tilnærmingen gir nå mulighet for direkte høyoppløselig funksjonell analyse av mitokondrieionkanaler og transportører som er ansvarlige for mitokondrietermogenese. For å lette utvidelsen av metoden og for å utfylle andre studier som mitokondrie-respirasjon, er en detaljert protokoll beskrevet nedenfor for måling av H ⁺ strømninger som bæres av UCP1 og AAC. Tre viktige trinn er beskrevet: 1) mitokondrieisolasjon fra musbrunt fett for å analysere UCP1-avhengig H ⁺ strøm og mitokondrieisolasjon fra hjertet for å analysere AAC-avhengig H ⁺ strøm, 2) tilberedning av mitoplaster med en fransk presse for mekanisk brudd på den ytre mitokondriemembranen (OMM), 3) patch-klemmeopptak av UCP1 og AAC-avhengige H ⁺ strømmer over hele IMM.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer for dyr som ble utført, samsvarer med National Institutes of Health-retningslinjene og ble godkjent av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). MERK: Mitokondrieisolasjonsprosedyren er basert på differensial sentrifugering og varierer litt fra vev til vev. For eksempel, siden brunt fettvev er ekstremt rik på lipider, krever det et ekstra skritt for å skille celleavfall og organeller fra lipidfasen før høstin…

Representative Results

Utviklingen av patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier, ga den første direkte studien av H + lekkasje gjennom IMM og mitokondrietransportører, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analysen av UCP1- og AAC-avhengige H+ lekkasjer kan gi et første blikk på den termogene kapasiteten til mitokondrier. Resultatdelen beskriver standardprosedyrene for å måle H+ lekkasje via UCP1 og AAC. UCP1-avhengig H+ gjelde…

Discussion

Denne metodeartikkelen tar sikte på å presentere patch-clamp teknikken som nylig ble brukt på mitokondrier, en ny tilnærming for å direkte studere H ⁺ lekkasje gjennom IMM ansvarlig for mitokondrie termogenese 5,6,7,15. Denne teknikken er ikke begrenset til vev og kan også brukes til å analysere H ⁺ lekkasje og andre ledninger av IMM i forskjellige standard menneske…

Materials

0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253