El uso de la técnica Patch-Clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias
Summary
Este artículo de método detalla los principales pasos para medir la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna con la técnica patch-clamp, un nuevo enfoque para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias.
Abstract
La termogénesis mitocondrial (también conocida como desacoplamiento mitocondrial) es uno de los objetivos más prometedores para aumentar el gasto de energía para combatir el síndrome metabólico. Los tejidos termogénicos como las grasas marrones y beige desarrollan mitocondrias altamente especializadas para la producción de calor. Las mitocondrias de otros tejidos, que producen principalmente ATP, también convierten hasta el 25% de la producción total de energía mitocondrial en calor y, por lo tanto, pueden tener un impacto considerable en la fisiología de todo el cuerpo. La termogénesis mitocondrial no solo es esencial para mantener la temperatura corporal, sino que también previene la obesidad inducida por la dieta y reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) para proteger las células del daño oxidativo. Dado que la termogénesis mitocondrial es un regulador clave del metabolismo celular, una comprensión mecanicista de este proceso fundamental ayudará en el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial. Es importante destacar que los mecanismos moleculares precisos que controlan la activación aguda de la termogénesis en las mitocondrias están mal definidos. Esta falta de información se debe en gran medida a la escasez de métodos para la medición directa de proteínas de desacoplamiento. El reciente desarrollo de la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias permitió, por primera vez, el estudio directo del fenómeno en el origen de la termogénesis mitocondrial, fuga de H+ a través de la IMM, y la primera caracterización biofísica de los transportadores mitocondriales responsables de la misma, la proteína desacoplamiento 1 (UCP1), específica de las grasas marrones y beige, y el transportador ADP/ATP (AAC) para todos los demás tejidos. Este enfoque único proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fuga de H + y la termogénesis mitocondrial y cómo se pueden dirigir para combatir el síndrome metabólico. Este artículo describe la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias para estudiar su capacidad termogénica midiendo directamente las corrientes H+ a través del IMM.
Introduction
Las mitocondrias son famosas por ser la central eléctrica de la célula. De hecho, son la principal fuente de energía química, el ATP. Lo que es menos conocido es que las mitocondrias también generan calor. De hecho, cada mitocondria genera constantemente los dos tipos de energías (ATP y calor) y un fino equilibrio entre las dos formas de energía define la homeostasis de las células metabólicas (Figura 1). Cómo las mitocondrias distribuyen la energía entre el ATP y el calor es sin duda la pregunta más fundamental en el campo de la bioenergética, aunque todavía es en gran parte desconocida. Sabemos que el aumento de la producción de calor mitocondrial (llamado termogénesis mitocondrial) y, en consecuencia, la reducción de la producción de ATP aumenta el gasto de energía y esta es una de las mejores maneras de combatir el síndrome metabólico1.
La termogénesis mitocondrial se origina a partir de la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna (IMM), lo que lleva al desacoplamiento de la oxidación del sustrato y la síntesis de ATP con la consiguiente producción de calor, de ahí el nombre de “desacoplamiento mitocondrial”1 (Figura 1). Esta fuga de H + depende de transportadores mitocondriales llamados proteínas de desacoplamiento (UCP). UCP1 fue el primer UCP identificado. Solo se expresa en tejidos termogénicos, grasa marrón y grasa beige en los que las mitocondrias están especializadas para la producción de calor 2,3,4. La identidad de la UCP en tejidos no adiposos como el músculo esquelético, el corazón y el hígado, ha seguido siendo controvertida. Las mitocondrias en estos tejidos pueden tener alrededor del 25% de la energía mitocondrial total convertida en calor, lo que puede afectar significativamente la fisiología de todo el cuerpo1. Además de mantener la temperatura corporal central, la termogénesis mitocondrial también previene la obesidad inducida por la dieta al reducir las calorías. Además, reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por las mitocondrias para proteger a las células del daño oxidativo1. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial está involucrada en el envejecimiento normal, los trastornos degenerativos relacionados con la edad y otras afecciones que involucran estrés oxidativo, como la isquemia-reperfusión. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial es un poderoso regulador del metabolismo celular, y una comprensión mecanicista de este proceso fundamental promoverá el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial.
La respiración mitocondrial fue la primera técnica en revelar el papel crucial de la termogénesis mitocondrial en el metabolismo celular y sigue siendo la más popular en la comunidad1. Esta técnica se basa en la medición del consumo de oxígeno por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) que aumenta cuando se activa la fuga mitocondrial de H+. Esta técnica, aunque instrumental, no puede estudiar directamente la fuga mitocondrial de H+ a través de la IMM1, lo que dificulta la identificación y caracterización precisa de las proteínas responsables de ella, particularmente en tejidos no adiposos en los que la producción de calor es secundaria en comparación con la producción de ATP. Recientemente, el desarrollo de la técnica patch-clamp aplicada a las mitocondrias, proporcionó el primer estudio directo de fuga de H + a través de toda la IMM en varios tejidos 5,6,7.
El parche-pinza mitocondrial de toda la IMM fue establecido por primera vez de forma reproducible por Kirichok et al.8. Describieron la primera medición directa de las corrientes de uniporter de calcio mitocondrial (MCU) en 2004 utilizando mitplastos de líneas celulares COS-78. Más tarde, el laboratorio de Kirichok mostró corrientes de calcio de IMM de ratón9 y tejidos de Drosophila 9. Otros laboratorios ahora usan rutinariamente esta técnica para estudiar las propiedades biofísicas de MCU 10,11,12,13,14. El análisis completo de la pinza de parche IMM de la conductancia de potasio y cloruro también es posible y se ha mencionado en varios artículos, pero aún no ha sido el tema principal de una publicación 6,7,9. La primera medición de las corrientes H + a través de la IMM se informó en 2012 de las mitocondrias de grasa marrónde ratón 6, y de las mitocondrias de grasa beige de ratón en 20177. Esta corriente se debe a la proteína desacoplamiento específica de los tejidos termogénicos, UCP1 6,7. Un trabajo reciente publicado en 2019 caracterizó la CAA como la principal proteína responsable de la fuga mitocondrial de H + en tejidos no adiposos como el corazón y el músculo esquelético5.
Este enfoque único ahora permite el análisis funcional directo de alta resolución de los canales iónicos mitocondriales y los transportadores responsables de la termogénesis mitocondrial. Para facilitar la expansión del método y complementar otros estudios como la respiración mitocondrial, a continuación se describe un protocolo detallado para medir las corrientes H + transportadas por UCP1 y AAC. Se describen tres pasos importantes: 1) aislamiento mitocondrial de la grasa marrón del ratón para analizar la corriente H + dependiente de UCP1 y aislamiento mitocondrial del corazón para analizar la corriente H + dependiente de CAA, 2) preparación de mitplastos con una prensa francesa para la ruptura mecánica de la membrana mitocondrial externa (OMM), 3) registros de pinza de parche de las corrientes H + dependientes de UCP1 y CAA en toda la IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo de método tiene como objetivo presentar la técnica patch-clamp aplicada recientemente a las mitocondrias, un nuevo enfoque para estudiar directamente la fuga de H+ a través de la IMM responsable de la termogénesis mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica no se limita a los tejidos y también se puede utilizar para analizar la fuga de H + y otras conductancia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradezco al Dr. Yuriy Kirichok por la gran ciencia de la que formé parte en su laboratorio y a los miembros del laboratorio Kirichok por las útiles discusiones. También agradezco al Dr. Douglas C. Wallace por proporcionar ratones knockout AAC1 . Financiamiento: A.M.B fue apoyado por un Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Referências
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