全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖
Summary
神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。
Abstract
神経筋接合部(NMJ)は、運動神経と骨格筋の間の特殊な接触点である。この周辺シナプスは、高い形態学的および機能的可塑性を示す。多くの神経系障害において、NMJは神経伝達障害、衰弱、萎縮、さらには筋線維死に至る初期の病理学的標的である。その関連性により、NMJコンポーネント間の関係の特定の側面を定量的に評価する可能性は、その組み立て/分解に関連するプロセスを理解するのに役立ちます。筋肉を扱うときの最初の障害は、繊維を傷つけることなく迅速に識別し、解剖するための技術的専門知識を得ることである。第2の課題は、高品質な検出方法を用いて、定量分析に使用できるNMJ画像を取得することです。この記事では、ラットから伸び器ジジドーラムロンゴラスとソレウスの筋肉を解剖するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。また、全型NJのプリリシナプス要素とポストナプティクス要素を視覚化するための免疫蛍光の使用についても説明しています。得られた結果は、この技術がシナプスの顕微鏡解剖学を確立し、生理学的または病理学的条件下でのその成分の一部の状態の微妙な変化を特定するために使用できることを実証する。
Introduction
哺乳動物神経筋接合部(NMJ)とは、運動ニューロン神経終末部、骨格筋線維上のポストナプティック膜、及びシュワン細胞1、2、3の末端からなる大きなコリン作動性三者分裂性シナプスである。このシナプスは、MJが動的構造修飾を受けることができる成人期においても、高形態学的および機能的可塑性4、5、6、7、8を示す。例えば、一部の研究者は、運動神経終末がマイクロメートルスケール9で絶えず形を変えることを示している。また、NMJの形態は、機能的要件、変更された使用、老化、運動、または運動活動4、10、11、12、13、14、15の変動に応答することが報告されている。したがって、トレーニングと使用の欠如は、NMJのいくつかの特性を変更するための本質的な刺激を表し、そのサイズ、長さ、シナプス小胞および受容体の分散、ならびに神経末分岐14、16、17、18、19、20などである。
さらに、この重要な接合の構造変化または変性は、運動ニューロン細胞死および筋萎縮21をもたらす可能性があることを示している。また、神経と筋肉間のコミュニケーションの変化は、生理学的な加齢に伴うNMJの変化と、おそらく病理学的状態におけるその破壊の原因となり得ると考えられている。神経筋接合部解体は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症において重要な役割を果たすが、これは、筋神経相互作用障害の最良例の1つを構成する神経変性疾患である3。運動ニューロン機能障害に関して行われた数多くの研究にもかかわらず、ALSで観察された劣化が運動ニューロンへの直接的な損傷のために起こり、その後コルチコ脊髄投影22に及ぶかどうかはまだ議論されている。または、変性が神経終末で始まり、運動ニューロンソマ23、24に向かって進行する遠位奇数症と考えるべきである場合。ALS病理の複雑さを考えると、独立したプロセスの組み合わせが起こることを考慮することは論理的です。NMJは筋肉と神経の間の生理病理学的相互作用の中心的なプレーヤーであるため、その不安定化は分析されるべき関連する疾患の起源における極めて重要なポイントを表す。
哺乳類の神経筋系は、機能的に、運動ニューロンとその神経末端によって排他的に内在する筋線維からなる離散運動単位に編成される。各モータユニットは、構造特性および機能特性が25に類似しているか、同一の繊維を有する。運動ニューロン選択的リクルートメントは、機能的要求に対する筋肉応答を最適化することを可能にする。哺乳類の骨格筋は4種類の異なる繊維で構成されているのは明らかです。いくつかの筋肉は、最も豊富な繊維の種類の特性に応じて命名されています。例えば、ソレウス(体の姿勢の維持に関与する後肢の後肢)は、遅いけいれんユニット(タイプ1)の大部分を担い、遅い筋肉として認識される。代わりに、伸びジデンソルロンゴ(EDL)は本質的に同様の高速けいれん特性(タイプ2繊維)を持つ単位で構成され、運動に必要なフェジス運動に特化した高速筋肉として知られています。つまり、成人の筋肉はホルモンや神経の影響により自然の中ではプラスチックであるが、その繊維組成は、連続的な低強度活性を経験するソレソウスと、より急速な単一のけいれんを示すEDLに見られるように、異なる活性を行う能力を決定する。異なるタイプの筋線維の中で可変的である他の特徴は、その構造(ミトコンドリア含有量、サルコプラズムレチクルの拡張、Z線の厚さ)、ミオシンATPase含有量、およびミオシン重鎖組成物26、27、28、29に関連している。
げっ歯類のNJの場合、筋肉28、29の間で有意な違いがあります。ラットからソレウスとEDLで行われた形態測定解析は、シナプス領域と繊維径との間に正の相関関係を明らかにした(すなわち、ソレウス遅繊維におけるシナプス領域はEDL高速繊維よりも大きい)が、NMJ面積と繊維サイズの比率は両方の筋肉30,31で類似している。また、神経末端に関しては、1型繊維のエンドプレート絶対領域は2型繊維よりも低く、一方、繊維径による正規化は1型繊維の神経末端の領域を最大32にした。
しかし、NMJ成分33,34の変化の証拠を示す形態解析に焦点を当てた研究はほとんどない。したがって、様々な病理において形態や生理学が変化する生物の機能におけるNMJの関連性のために、NMJ構造全体の可視化を可能にする十分な品質で異なるタイプの筋肉の解剖プロトコルを最適化することが重要である。また、老化や運動35、36、37、38などの異なる実験状況または条件における前または後の昼寝の変化の発生を評価する必要があります。また、ALS39に報告されているように、末端神経終末における神経フィラメントリン酸化の変化などのNMJ成分においてより微妙な変化を証明するのに役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、2つのラット骨格筋(1つの遅いけいれんと他の速いけいれん)、線維筋分離およびNMJの変化および組み立て/分解プロセスを定量的に評価するための前および後回しマーカーの免疫蛍光検出の解剖のための詳細なプロトコルを提示する。この種のプロトコルは、ALS hSOD1G93Aラットに見られるような運動ニューロン変性のモデルでここで例示される生理学的または病理学的プロセス中にNMJ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事に与えられた財政支援のためのCSICとPEDECIBAに感謝します。彼女の原稿の訂正のためにナタリア・ロサノに。ビデオを作るマルセロ・カサキューブルタとそれに彼の声を貸すためにニコラス・ボラットに。
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
Referências
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