צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים
Summary
מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.
Abstract
סחר אנדוסומלי הוא תהליך תאי חיוני המסדיר מגוון רחב של אירועים ביולוגיים. חלבונים מופנמים מקרום הפלזמה ולאחר מכן מועברים לאנדוזומים המוקדמים. החלבונים המופנמים יכולים להיות מועברים ליזוזום להשפלה או ממוחזר בחזרה לקרום הפלזמה. מסלול מיחזור אנדוציטי חזק נדרש כדי לאזן את הסרת חומרי הממברנה מאנדוציטוזיס. חלבונים שונים מדווחים כדי לווסת את המסלול, כולל גורם ADP-ריבוסילציה 6 (ARF6). אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא שיטה קלאסית לפירוק תאים. לאחר הצנטריפוגה, אברונים הם משקעים על פני השטח האיזופקניים שלהם. השברים נאספים ומשמשים עבור יישומים אחרים במורד הזרם. מתואר כאן פרוטוקול להשגת שבר המכיל אנדוזום ממחזור מתאי יונקים שהודבקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. השברים המבודדים היו נתונים לכתמים מערביים סטנדרטיים לניתוח תכולת החלבון שלהם. על ידי שימוש בשיטה זו, זיהינו כי מיקוד קרום הפלזמה של בלוע תנועתיות תא 1 (ELMO1), מצע רעלן בוטולינום C3 הקשורים לראס 1 (Rac1) גורם החלפת נוקלאוטידים גואנין, הוא באמצעות מיחזור אנדוציטי בתיווך ARF6.
Introduction
סחר אנדוסומלי הוא תהליך פיזיולוגי חיוני המסבך אירועים ביולוגיים שונים1, למשל, הובלה של קולטני איתות, תעלות יונים ומולקולות הידבקות. חלבונים מקומיים בקרום הפלזמה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס2. החלבונים המופנמים ממוינים לאחר מכן על ידי אנדוזום מוקדם3. חלק מהחלבונים מיועדים ליזוזומים להשפלה4. עם זאת, כמות משמעותית של חלבונים ממוחזרים בחזרה לפני השטח של התא על ידי מיחזור מהיר ותהליכי מיחזור איטיים. במיחזור מהיר, חלבונים לעזוב את אנדוזומים המוקדמים ולחזור ישירות קרום הפלזמה. לעומת זאת, במיחזור איטי, חלבונים ממוינים תחילה לתא המיחזור האנדיוציטי ולאחר מכן מועברים בחזרה לקרום הפלזמה. חלבוני מטען שונים, למשל, קלתרין, קומפלקס רטרומר, קומפלקס רטריבר וחלבון תסמונת ויסקוט-אולדריץ ‘, ותסביך SCAR Homologue (WASH), משתתפים בתהליכי מיחזור ממברנה כאלה4,5,6,7,8,9. האיזון של אירוע אנדוציטוזיס ומיחזור הוא חיוני להישרדות התא ותורם לאירועים תאיים שונים10, למשל, הידבקות תאים, נדידת תאים, קוטביות התא, טרנסדוקציה של אותות.
ARF6, GTPase קטן, הוא רגולטור דיווח של סחר אנדוציטי7,11,12. מעניין, קבוצות מחקר שונות המחישו את החשיבות של ARF6 במיחזור אנדוציטי13,14,15,16,17. מטרת המחקר היא לחקור את הקשר בין תולדת הנויריט בתיווך ARF6 לבין מיחזור אנדוציטי. הדו”ח הקודם מציע כי ההפעלה של ARF6 היא במעלה הזרם לפעילות Rac1 באמצעות פועל על ELMO1-dedicator של ציטוקינזיס 1 (DOCK180)קומפלקס 18. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד ARF6 מפעיל את איתות Rac1 המתווך של ELMO1-DOCK180. צפיפות הדרגתית אולטרה צנטריפוגה הועסק כדי לחקור את התפקיד של ARF6 בתיווך מיחזור אנדוציטי בתהליך כזה. באמצעות זה, השבר המכיל אנדוזום מיחזור הושג מ lysates התא19. השבר היה נתון לכתמים מערביים לניתוח תכולת חלבון. תוצאות החיסון חשפו כי תחת נוכחותו של FE65, חלבון מתאם מועשר במוח, ARF6 פעיל הגדיל באופן משמעותי את רמת ELMO1 בשבר המכיל אנדוזום מיחזור. הפרוטוקול הבא כולל את הנהלים ל(1) תאים יונקים; (2) הכנת הדגימות ועמודות מעבר צבע בצפיפות; ות (3) קבלת השבר המכיל אנדוזום למיחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול לעיל מתאר את הנהלים לבידוד אנדוזומים של מיחזור תרבית על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. האמינות של שיטה זו הוכח על ידי הפרסום האחרון22, המוכיח כי מיחזור אנדוזומים מבודדים בהצלחה אברונים אחרים (איור 1), כגון מנגנון Golgi ומיטוכונדריה. יש לשים לב לכמה צעדים קריטיים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממועצת מענקי המחקר בהונג קונג, תוכנית המענקים הישירים של CUHK, קרן ההקדש של מכללת יונייטד וקרן הצדקה TUYF. הנתונים בעבודה זו הותאמו מהפרסום הקודם שלנו, “ARF6-Rac1 איתות-תיווך נורייט גדל הוא potentiated על ידי מתאם עצבי FE65 באמצעות תזמור ARF6 ו ELMO1” שפורסם בכתב העת FASEB באוקטובר 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
Referências
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome – sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O’Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D’Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D’Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Pesquisa do Câncer. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).
