स्तनधारी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की जांच के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन
Summary
इस पेपर का उद्देश्य सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करना है।
Abstract
एंडोसोमल तस्करी एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जो जैविक घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को नियंत्रित करती है। प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली से आंतरिक होते हैं और फिर शुरुआती एंडोसोम्स में ले जाया जाता है। आंतरिक प्रोटीन को गिरावट के लिए लाइसोसोम में ले जाया जा सकता है या प्लाज्मा झिल्ली में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है। एंडोसाइटोसिस से झिल्ली सामग्री को हटाने को संतुलित करने के लिए एक मजबूत एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग मार्ग की आवश्यकता होती है। पाथवे को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रोटीन की सूचना दी जाती है, जिसमें एडीपी-रिबोसिलेशन फैक्टर 6 (ARF6) शामिल है । घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन कोशिका अंश के लिए एक शास्त्रीय विधि है। अपकेंद्रित्र के बाद, ऑर्गेनेल्स को उनकी आइसोपिक सतह पर तलछट किया जाता है। अंश एकत्र किए जाते हैं और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं। यहां वर्णित घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। अलग अंशों को उनके प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। इस विधि को नियोजित करके, हमने पहचान की कि चपेट और सेल मोटिविटी 1 (ELMO1), एक रास से संबंधित C3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट 1 (Rac1) ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर का प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्यीकरण, ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के माध्यम से होता है।
Introduction
एंडोसोमल ट्रैफिकिंग एक आवश्यक शारीरिक प्रक्रिया है जो विभिन्न जैविक घटनाओं को फंसाती है1,उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग रिसेप्टर्स, आयन चैनल और आसंजन अणुओं का परिवहन। प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीय प्रोटीन एंडोसाइटोसिस2द्वारा आंतरिक होते हैं। इसके बाद आंतरिक प्रोटीन को प्रारंभिक एंडोसोम 3 द्वारा छांटाजाताहै । कुछ प्रोटीन ों को4गिरावट के लिए लाइसोसोम्स करने का लक्ष्य रखा गया है । हालांकि, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण राशि तेजी से रीसाइक्लिंग और धीमी रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं द्वारा सेल की सतह पर वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं । फास्ट रीसाइक्लिंग में प्रोटीन शुरुआती एंडोसोम्स को छोड़ देते हैं और सीधे प्लाज्मा झिल्ली में लौट जाते हैं। इसके विपरीत, धीमी रीसाइक्लिंग में, प्रोटीन को पहले एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग डिब्बे में हल किया जाता है और फिर प्लाज्मा झिल्ली में वापस ले जाया जाता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न कार्गो प्रोटीन, क्लैथ्रिन, रेट्रोमर कॉम्प्लेक्स, कुत्ता जटिल और विस्कोट-एल्ड्रिच सिंड्रोम प्रोटीन, और निशान होमोलॉग (वॉश) परिसर, ऐसी झिल्ली रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं4,5,6,7,8,9। एंडोसाइटोसिस और रीसाइक्लिंग इवेंट का संतुलन सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न सेलुलर घटनाओं10में योगदान देता है, उदाहरण के लिए, सेल आसंजन, सेल माइग्रेशन, सेल पोलरिटी और सिग्नल ट्रांसडक्शन।
ARF6, एक छोटा जीटीपीए,एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग7,11,12का एक सूचित नियामक है। रुचि के साथ, विभिन्न शोध समूहों ने एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग13 , 14, 15,16,17में ARF6केमहत्व को दर्शाया है। इस अध्ययन का उद्देश्य ARF6-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ और एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के बीच संबंधों की जांच करना है । पिछली रिपोर्ट से पता चलता है कि ARF6 की सक्रियता CYTOkinesis 1 (DOCK180) जटिल 18 के ELMO1-समर्पित पर अभिनय के माध्यम सेRac1गतिविधि के लिए अपस्ट्रीम है । हालांकि, कैसे ARF6 ELMO1-DOCK180 मध्यस्थता Rac1 संकेत से चलाता है अस्पष्ट रहता है । इस तरह की प्रक्रिया में ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की भूमिका की जांच करने के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन नियोजित किया गया था। इसका उपयोग करके, रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश को सेल लाइसेट्स19से प्राप्त किया गया था। अंश प्रोटीन सामग्री विश्लेषण के लिए पश्चिमी दाग के अधीन था । इम्यूनोब्लॉट परिणामों से पता चला है कि FE65 की उपस्थिति के तहत, एक मस्तिष्क समृद्ध एडाप्टर प्रोटीन, सक्रिय ARF6 ने रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश में ELMO1 के स्तर को काफी बढ़ा दिया। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने वाली (1) के लिए प्रक्रियाएं शामिल हैं; (2) नमूने और घनत्व ढाल कॉलम तैयार करना; और (3) रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करना।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त प्रोटोकॉल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम को अलग करने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। इस विधि की विश्वसनीयता को नवीनतम प्रकाशन22द्वार?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रिसर्च ग्रांट काउंसिल हांगकांग, सीयूएचके डायरेक्ट ग्रांट स्कीम, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट के फंड्स ने सपोर्ट किया । इस काम के आंकड़े हमारे पिछले प्रकाशन से अनुकूलित किए गए थे, “ARF6-Rac1 सिग्नलिंग-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ को अक्टूबर 2020 में फासेब जर्नल में प्रकाशित ARF6 और ELMO1 के माध्यम से न्यूरोनल एडाप्टर FE65 द्वारा शक्तिशाली है।
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
Referências
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