Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.
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Artigo de método
Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.
Introdução
O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos1, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose2. As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosommaprecoce 3. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação4. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem ....
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Protocolo
1. Cultura e transfecção de células mamíferas
- Placa 2 x 106 células em um prato de cultura de 100 mm. Use quatro pratos para cada transfecção.
NOTA: O número de células necessárias pode variar para diferentes linhas celulares. A otimização pode ser necessária antes de prosseguir para a etapa de isolamento. - No dia seguinte, transfete as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante.
2. Colheita celular
- Descarte o meio de cultura 48 h pós-transfecção.
- Lave as células com PBS gelado (fosfatos de sódio de 10 mM, cloreto de potássio de 2,68 mM, cloreto de sódio de ....
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Resultados
Após fracionar as células HEK293 não traduzidas por ultracentrifugação gradiente de densidade, 12 frações foram coletadas a partir do topo do gradiente. As frações colhidas foram diluídas com o tampão de diluição em uma razão de 1:1 e submetidas a uma segunda rodada de centrifugação. As amostras foram então submetidas a manchas ocidentais para análise de seu conteúdo proteico. Como mostrado na Figura 1,o marcador de reciclagem endosome Rab11 é detectado na fração 720........
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Discussão
O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela últimapublicação 22, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacarose, recomenda-s.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos do Research Grants Council Hong Kong, cuhk direct grant scheme, United College endowment fund, e tuyf Charitable Trust. Os números deste trabalho foram adaptados de nossa publicação anterior, "ARF6-Rac1- a propagação de neurite mediada por sinalização é potencializado pelo adaptador neuronal FE65 através da orquestração ARF6 e ELMO1" publicada no FASEB Journal em outubro de 2020.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 mL, tubo de polipropileno de parede espessa de topo aberto, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| placa de cultura de tecidos de 100 mm | SPL | 20100 | |
| 13,2 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto certificado gratuitamente, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x tampão de amostra | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, coquetel de inibidor de protease sem EDTA | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Tecnologia | de sinalização celular | 4850S | Anticorpo monoclonal de coelho para detecção de COX IV. |
| Cicloheximida | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com baixa glicose | HyClone | SH30021.01 | |
| anticorpo ELMO1 (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 anticorpo (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Anticorpo policlonal de cabra para detecção de FE65. |
| Soro bovino fetal, grau de pesquisa | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Anticorpo monoclonal (6C5) | Ambion | AM4300 | Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de GAPDH. |
| Software ImageLab | Bio-Rad | Medição da intensidade da banda | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP anticorpo | Sigma | G6160 | Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de β-COP. |
| Tecnologia de sinalização celular | mAb de camundongo Myc-tag (9B11) | 2276S | Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de proteínas marcadas com myc. |
| OmniPur EDTA, sal dissódico, dihidrato | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Mídia de soro reduzida | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | ||
| Anticorpo policlonal específico RAB11A | Proteintech | 20229-1-AP | Anticorpo policlonal de coelho para detecção de Rab11. |
| Sacarose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Rotor de Balde Oscilante | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Rotor de ângulo fixo | Beckman Coulter | 362046 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Gibco | 25300062 |
Referências
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research.
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Reimpressões e permissões
