MERK: Denne protokollen beskriver klargjøring av cellefritt TX-TL-system fra rekombinante komponenter. For enkelhets skyld er arbeidet delt inn i fem deler. Den første delen beskriver forberedelsestrinn, som bør gjøres før du starter protokollen. Den andre delen beskriver utarbeidelsen av OnePot proteinoppløsningen. Den tredje delen beskriver ribosomrensinger, den fjerde delen beskriver utarbeidelsen av energiløsningen, og den siste delen gir en håndbok for å sette opp en PURE-reaksjon. For enkelhets skyld er protokollene delt inn i dager og oppsummert i daglige tidsplaner i tabell 1. Etter tidsplanen kan hele systemet utarbeides om 1 uke av en person. 1. Forarbeid Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1. Forbered og steriliser materialene som kreves, inkludert pipettespisser, 96 dypbrønnplater. Sil av preparatet Transformer uttrykksstammene som er angitt i tabell 2, med de tilsvarende uttrykksvektorene ved hjelp av varmesjokkmetoden. Tilsett renset plasmid til de kjemisk kompetente bakteriene og inkuber på is i 20-30 min. Plasser blandingen ved 42 °C i 30 s (varmesjokk) og legg den deretter tilbake på is i 2 minutter. Pipette 20 μL av bakteriene direkte på agarplater som inneholder ampicillin (AMP) og inkuberer ved 37 °C over natten. Oppbevar platene ved 4 °C i opptil 1 uke. Inokuler 3 ml LB-medier som inneholder AMP med en enkelt koloni av bakterier fra agarplatene. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten. Bland 250 μL av kulturen med 250 μL 50% (v / v) glyserol og lagre ved -80 °C.MERK: For raskere tilberedning i fremtiden, oppbevar stammene i en 96-brønnsplate som glyserollagre. Bekreft alle vektortransformasjoner etter koloni PCR og sekvensering. Sekvenser genet, promotorregionen og ribosomets bindingssted. Test av uttrykk Inokkuler 300 μL LB-medier som inneholder AMP med rundt 1 μL av de tilberedte glyserollagrene i en 1,3 ml dypbrønnplate. Forsegle platen med en pustende membran og inkuber deretter ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten.MERK: Alle uttrykk gjøres separat på dette tidspunktet. Inokuler 300 μL ferske LB-medier som inneholder AMP med 1 μL av nattkulturene. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten. Etter 2 timer induser cellene med 100 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og vokse i ytterligere 3 timer. Bland 10 μL av kulturen med 10 μL 2x Laemmli buffer og varme til 95 °C i 10 minutter. Snurr prøvene i 1 min ved hjelp av en bordsentrifuge og last 10 μL av supernatanten på en PAGE gel. Kjør gelen i Tris/Glycine/SDS buffer ved 200 V i 30 min. Skyll det godt med deionisert vann. Dekk gelen med en Coomassie proteinflekk og inkuber i 1 time. Destain gelen i vann om nødvendig (representative resultater for uttrykkstesten i figur 1).MERK: Bruk gradient (4%-15% eller 4%-20%) PAGE gels for å oppnå en god separasjon. IMAC Sepharose harpiks restaurering og rengjøring Kolonneforberedelse. Bland Sepharose harpiks godt ved virveling. Pipette den nødvendige mengden harpiks inn i en tom gravitasjonsstrømningskolonne.MERK: Mengden harpiks som kreves varierer mellom his-ribosomrensing og proteinrensing og er spesifisert i de respektive seksjonene. Vask harpiksen med 30 ml deionisert vann. Fortsett med kolonneoppladning som angitt i avsnitt 1.4.4.MERK: La alltid all væsken passere gjennom kolonnen før du fortsetter med neste trinn. Pass imidlertid på at kolonnen aldri går tørr. Når du kjører væske gjennom kolonnen, må du sørge for å stoppe strømmen eller fortsette til neste trinn så snart væsken når harpiksen. Restaurering. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann. Påfør 10 ml av en 0,2 M EDTA- og 0,5 M NaCl-løsning. Tilsett 30 ml av en 0,5 M NaCl-løsning. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann. Oppbevars i 20 % (v/v) etanol ved 4 °C, eller fortsett med neste trinn. Renhold.FORSIKTIG: Bruk verneutstyr. Vask kolonnen med 30 ml 0,5 M NaOH. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann. Vask kolonnen med 30 ml 0,1 M eddiksyre. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann. Vask kolonnen med 30 ml 70% (v / v) etanol. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann. Oppbevars i 20 % (v/v) etanol ved 4 °C, eller fortsett med neste trinn. Lader på nytt. Tilsett 10 ml 0,1 M nikkelsulfatoppløsning i kolonnen.FORSIKTIG: Nikkelsulfat er giftig. Nikkelsulfatavfall må kastes med forholdsregler som er angitt av leverandøren. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann. Oppbevares i 20 % (v/v)) etanol ved 4 °C eller fortsett med kolonnelikevekten.MERK: Hvis kolonnen er lagret i etanol mellom trinnene, må du sørge for å fjerne alle spor av etanol ved å vaske kolonnen med vann. 2. OnePot proteinløsningsuttrykk og rensing MERK: Protokollen består av tre deler delt inn i dager (figur 2). En ideell forberedelsesprosedyre produserer 1,5 ml 13,5 mg/ml OnePot proteinoppløsning, som tilsvarer mer enn tusen 10 μL PURE-reaksjoner. Mengden og den ideelle konsentrasjonen av løsningen vil imidlertid variere fra batch til batch. Erfarne brukere kan utføre flere OnePot PURE-preparater om gangen. Dag 1: Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, to 96 dypbrønnplater og en 1 L forbløffet Erlenmeyer-kolbe. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle buffere ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C. Suppler alle bufferne med 1 mM TCEP rett før bruk, med mindre annet er angitt. Bruk 2 ml sepharoseharpiks til OnePot proteinrensing. Klargjør kolonnen som beskrevet i avsnitt 1.4. For å forberede startkulturene, kombiner 20 ml LB-medier med 20 μL AMP. I en steril 96, 1,3 ml dyp brønnplate, tilsett 300 μL av mediet i 35 brønner. Inokuler hver av dem med sin respektive stamme, unntatt forlengelsesfaktor termo ustabil (EF-Tu), og forsegle platen med en pustende membran.MERK: Inokuler platen ved hjelp av en 96-brønns replikator (se Materialtabell). Brønnvolumet på dypbrønnplaten og volumet av startkulturen er avgjørende. Større medievolumer eller mindre brønnvolumer vil føre til en annen bakteriell tetthet på grunn av lufting inkonsekvenser. For EF-Tu-kulturen inokulerer du 3 ml LB-medier i et 14 ml kulturrør med en snap cap. En enkelt 3 ml kultur for EF-Tu er tilstrekkelig for en OnePot-uttrykkskultur. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten. Dag 2:MERK: Utfør alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Overfør 500 ml LB-medier og 500 μL AMP til den sterile, forvirrede kolben. Inokuler OnePot PURE-kulturen med 1675 μL ef-tu-kulturen og 55 μL av hver av kulturene fra dypbrønnplaten (Tabell 2).MERK: I løpet av dette trinnet kan den totale proteinsammensetningen justeres ved å justere inokulasjonsforholdene. Pass på at det totale inokulasjonsvolumet forblir konstant ved 3,6 ml.VALGFRITT: For å bekrefte at alle stammer har vokst over natten, måler du den optiske tettheten til nattkulturene ved 600 nM (OD600) i en 96-brønnsplate ved hjelp av en plateleser. Bruk en fortynning på 10x for måling av optisk tetthet. Inkuber kulturen i 2 timer ved 37 °C med en risting på 260 o/min, eller til OD600 i kulturen når 0,2-0,3. Induser kulturen med 500 μL 0,1 mM IPTG og vokse i ytterligere 3 timer. Høst cellene ved sentrifugering ved 4 °C og 3220 x g i 10 minutter og oppbevar cellepellet ved -80 °C inntil videre bruk.MERK: For å optimalisere timingen, klargjør du energiløsningen som er beskrevet i avsnitt 4 under inkubasjonstidene på dag 2 (tabell 1). Dag 3: Mål mengdene buffere som trengs for rensingen som er beskrevet i trinnene nedenfor, og legg TCEP til dem alle som angitt i Supplerende tabell 2. Oppbevar de resterende bufferne uten TCEP ved 4 °C for fremtidige rensinger. Likevekt den ladede kolonnen (avsnitt 2.4) med 30 ml buffer A. Etter at 25 ml buffer A har passert, lukker du kolonnen fra bunnen. Parallelt fortsetter du med trinn 2.15-2.17. Tine cellene og bruk en serologisk pipette for å resuspendere cellepellet i 7,5 ml buffer A. Lyse cellene ved hjelp av en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer, sondespissdiameter: 6 mm) med følgende parametere: 4 x 20 s puls på, 20 s puls av, 70% amplitude. Hvis sonikeringen er vellykket, blir løsningen mørkere (figur 2).MERK: Sørg for å holde cellene på is under sonikering. Plasser sonden dypt nok inn i oppløsningen uten å berøre røret. Hvis en stor mengde skum genereres, vil energioverføringen bli dempet. I så fall, la skummet slå seg ned, senk sonden dypere inn i løsningen, og utvid sonikeringstiden. Fjern celleavfallet ved sentrifugering ved 21130 x g i 20 minutter ved 4 °C umiddelbart etter sonikering. Hold lysatet på isen. Legg til supernatanten i kolonnen med likevekt. Lukk kolonnen fra toppen og sørg for at det ikke er noen lekkasje. Inkuber søylen i 3 timer ved 4 °C under rotasjon ved hjelp av en rørrotator. Elute ubundne komponenter fra kolonnen og vask med 25 ml buffer A. Vask kolonnen med 25 ml 25 mM imidazolbuffer (23,95 ml buffer A og 1,25 ml buffer B). Elute proteinene med 5 ml 450 mM imidazolbuffer (0,5 ml buffer A og 4,5 ml buffer B). Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid. Fortynn eluatet med 25 ml HT-buffer, hold blandingen på is. Tilsett 15 ml til et 15 ml sentrifugalfilter og konsentrer deg til et volum på 1,5 ml. Tilsett de resterende 15 ml til filteret med den konsentrerte løsningen og konsentrer deg til 1,5 ml igjen. Tilsett 10 ml HT-buffer i den konsentrerte prøven og konsentrer deg til 1 ml. Tilsett en lik mengde lagerbuffer B og oppbevar ved -80 °C inntil videre bruk.MERK: En runde med utveksling/konsentrasjon tar ca. 60 min å spinne ved 3220 x g ved 4 °C. Under bufferutvekslingen gjenoppretter du kolonnen som angitt i del 1.4. Dag 4: Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen som beskrevet av leverandøren. Konsentrer prøven med en 0,5 ml 3 kDa avskåret sentrifugalfilter til 20 mg/ml.MERK: Fortynn proteinoppløsningen 25 ganger eller 50 ganger før konsentrasjonsmålingene for å unngå å oversaturere Bradford-analysen. For å etablere den ideelle proteinkonsentrasjonen, utfør en uttrykkstest på dette stadiet (avsnitt 5.2) med forskjellige konsentrasjoner av proteinoppløsningen. For å utføre titreringen, hold det totale volumet av løsningen konstant og pipette OnePot proteinoppløsningen, inkludert lagerbuffer B, ved fem forskjellige forhold (Supplerende tabell 7). Kontroller OnePot PURE-proteinsammensetningen ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3A). Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene til gelen. Kjør SDS-PAGE som angitt i avsnitt 1.3.3. Aliquot proteinoppløsningen i 50 μL aliquots etter å ha bekreftet uttrykket og justert konsentrasjonen. Oppbevar OnePot PURE-proteinløsningen ved -80 °C inntil videre bruk.MERK: Hvis en proteinkomponent mistenkes å ikke være til stede, eller er til stede i en lavere konsentrasjon enn forventet i OnePot PURE, utfører du følgende trinn. Sjekk om nattkulturen til den respektive stammen har vokst i sammenlignbar hastighet med de andre kulturene ved å utføre optiske tetthetsmålinger (OD600) av alle kulturer. Utfør en ekstra uttrykkstest av den spesifikke stammen for å verifisere uttrykket av det mistenkte proteinet. 3. Ribosomløsning MERK: To forskjellige ribosomrensingsstrategier er introdusert, en for heksahekshistidin-merket og en for ikke-taggede ribosomer. Den største fordelen med rensingsmetoden ved hjelp av his-rensing på en standard affinitet Ni-NTA gravitasjonsstrømningskolonne er at rensingen er enkel, rask og ikke krever ekstra laboratorieutstyr, for eksempel et FPLC-system og en ultracentrifuge. Proteinproduksjonskapasiteten i OnePot PURE-reaksjoner er imidlertid rundt en tredjedel sammenlignet med tagfrie ribosomer. Velg derfor metoden for ribosomproduksjon basert på om et høyt utbytte er viktig for den gitte applikasjonen. Hans-tagget ribosom rensingMERK: Denne protokollen bruker E. coli RB1-stammen, en gave fra professor Wang (Columbia University, USA)18. Denne stammen har en genomisk innsetting av en heksamhistidin tag på C-endestasjonen av 50S ribosomalt protein (L7/ L12), noe som muliggjør rensing ved hjelp av en Ni-NTA tyngdekraftsstrømningskolonne. Det vanlige utbyttet er rundt 0,5 ml 3,45 μM ribosomer, noe som er tilstrekkelig for mer enn fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner. Dag 1: Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, en 5 L Erlenmeyer-kolbe og en 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle bufferne ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C. Dag 2: Pipette 5 ml harpiks til en kolonne og klargjør kolonnen som angitt i pkt. 1.4.MERK: På grunn av det høyere volumet av harpiksen tar restaureringen og rensingen betydelig lengre tid. Bruk en annen kolonne for ribosomrensing for å unngå krysskontaminering og rengjør den grundig før rensingen. Forbered en nattkultur av E. coli RB1-stammen ved å inokulere 35 ml LB-medier i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min. Dag 3:MERK: Utfør alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Tilsett 2 L LB-medier i en 5 L steril kolbe, inokuler med 12 ml av nattkulturen, og inkuber deretter i 3-4 timer ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min.MERK: Alternativt kan du utføre bakteriell dyrking i 4 x 500 ml kulturer i 1 L forbløffet kolber. Pellet cellene ved sentrifugering i 10 min ved 3220 x g og 4 °C. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk. Dag 4: Likevekt kolonnen som er utarbeidet i trinn 3.1.4. med 30 ml lysisbuffer. Resuspend pellet i 20 ml lysisbuffer ved hjelp av en serologisk pipette. Lyse cellene med en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer, sondespissdiameter: 6 mm) på is med følgende parametere: 11 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitude (se trinn 2.16 for prosedyredetaljer). Umiddelbart etter sonikering, fjern celleavfallet ved sentrifugering i 20 minutter ved 21130 x g ved 4 °C. Hold lysatet på isen. Last supernatanten til kolonnene og la den passere gjennom. Vask kolonnen med følgende blandinger av lysis og elutionbuffere. Vask 0: Bruk 30 ml lysisbuffer. Vask 1: Bruk 30 ml 5 mM imidazol (29 ml lysisbuffer, 1 ml elutionbuffer). Vask 2: Bruk 60 ml 25 mM imidazol (50 ml lysisbuffer, 10 ml elutionbuffer). Vask 3: Bruk 30 ml 40 mM imidazol (22 ml lysisbuffer, 8 ml elutionbuffer). Vask 4: Bruk 30 ml 60 mM imidazol (18 ml lysisbuffer, 12 ml elutionbuffer). Elute ribosomene med 7,5 ml av elutionbufferen. Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid. Tilsett 22 μL ren β-mercaptoetanol til 45 ml ribosolebuffer.FORSIKTIG: β-mercaptoetanol er giftig. Ta sikkerhetsforanstaltninger og arbeid i en avtrekkshette. Tilsett eluatet i et 15 ml sentrifugalfilter og konsentrer deg til 1 ml. Tilsett 15 ml ribosomebuffer i den konsentrerte prøven og konsentrer igjen til 1 ml.MERK: Gjenta forrige trinn to ganger. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.MERK: En runde utveksling/konsentrasjon tar ca. 60 min sentrifugering ved 3220 x g ved 4 °C. Under bufferutvekslingen gjenoppretter du kolonnen som angitt i del 1.4. Dag 5: Bestem ribosomkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nM av en prøve fortynnet 1:100 i ribosombuffer. En absorbansverdi på 10 av den fortynnede løsningen tilsvarer 23 μM ufortynnet løsning som tidligere beskrevet16. Implementer en endelig lagerkonsentrasjon på 3,45 μM. For å justere konsentrasjonen, fortynn ribosomene med ribosomebuffer eller konsentrer dem videre ved sentrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa 0,5 ml sentrifugalfilter ved 4 °C.MERK: For å oppnå optimalt systemuttrykk, utfør en ribosomekonsentrasjonstitrering (pkt. 5.2, supplerende tabell 7). Kontroller ribosomesammensetningen ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3A) som angitt i avsnitt 1.3.3. Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer, og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene på gelen. Tag-fri ribosome rensingMERK: Tag-fri ribosomrensing utføres ved hjelpavet FPLC-system ( Tabell over materialer ) og er basert på hydrofob interaksjonskromatografi ved hjelp av 2 x 5 ml butylkolonner (Materialtabell). Selv om ribosomer kan renses fra enhver stamme, er det fordelaktig å bruke E. coli A19 (E. coli Genetic Resources ved Yale CGSC) på grunn av RNase I-slettingen22. Utfør rensingen ved 4 °C i enten et kaldt rom eller et kjøleskap. Det vanlige utbyttet er rundt 0,5 ml 10 μM ribosomer, noe som tilsvarer mer enn fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner. Dag 1: Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, 5 L Erlenmeyer-kolbe og 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle bufferne ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C. Dag 2: For å forberede en nattkultur av E. coli A19-stammen, inokulere 35 ml LB-medier i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min. Dag 3: Overfør 2 L LB-medier til den sterile 5 L-hvelvede kolben, inokuler med 30 ml av nattkulturen, og inkuber deretter i 3-4 timer ved 37 °C mens du rister ved 200 o/min. Pellet cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C. Resuspend pellet i 25 ml suspensjon buffer og lagre ved -80 °C til videre bruk. Dag 4: Utfør trinn 3.2.8-3.2.12 parallelt med trinn 3.2.13-3.2.19. Tine og lyse cellene ved hjelp av en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer og sondespissdiameter: 6 mm) på is med følgende parametere: 12 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitude (se trinn 2.16 prosedyredetaljer). Fjern celleavfallet umiddelbart ved sentrifugering ved 20000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten og mål volumet. Tilsett et likt volum suspensjonsbuffer (høyt salt) for å justere den endelige konsentrasjonen av ammoniumsulfat til 1,5 M og bland godt. Fjern bunnfallet ved sentrifugering ved 20000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Filtrer supernatanten ved hjelp av et 0,45 μm polyetersulfonmembransprøytefilter før FPLC-rensing og samle filtratet i en 100 ml glassflaske. Hold supernatanten ved 4 °C til enhver tid. Sett opp FPLC-systemet for hydrofob interaksjonskromatografirensing ved hjelp av en dobbel Butyl-kolonne (2 x 5 ml) som følger. For dette oppsettet refererer ett kolonnevolum (CV) til et volum på 10 ml. Tre innløp vil være nødvendig: to som bufferlinjer og én som eksempellinje. På grunn av standardinnstillingene til renseren er det praktisk å velge linje A1 og B1 for henholdsvis buffer C og buffer D og linje A2 som prøvelinje. Bruk en standard strømningshastighet på 4 ml/min, med unntak av pumpevask (10 ml/min) eller med mindre annet er angitt.MERK: Siden TCEP er et kostbart reagens, legger du det tilsvarende beløpet til bufferne C og D først etter likevektstrinnet. Utfør en systempumpevask i 20% ((v/v)) etanol for å rengjøre systemet og fjerne potensiell forurensning fra tidligere rensinger. Still inn en strømningshastighet på 0,2 ml/min manuelt, og monter kolonnen. Stopp flyten. Utfør en systempumpevask med vann. Vask kolonnen med 3 CV vann. Likevekt: Plasser inlets A1 og A2 i buffer C og innløp B1 i buffer D uten TCEP. Utfør en pumpevask og likevekt kolonnen med 4 CV buffer C. Legg til TCEP i bufferne C og D. Forbered 15 ml rør eller klare runde fraksjonssamlerrør til fraksjonssamleren for å samle 4-5 ml elutionfraksjoner. Lasting: Plasser innløpet A2 i flasken med den filtrerte prøven. Last inn omtrent 90 % av prøvevolumet på kolonnen. Fortynn prøven med 20 ml TCEP-inneholdende buffer C, og last 10 ml av prøven på kolonnen. Gjenta fortynningstrinnet minst to ganger og last så mye prøve på kolonnen som mulig. Det er viktig å sikre at det ikke suges luft inn i maskinen. Vask trinn 1: vask med 3 CV buffer C for å fjerne de ubundne komponentene. Vask trinn 2: vask med 5 CV med 80% buffer C og 20% buffer D. Elution: elute produktet ved å bruke 50% av buffer C og 50% av buffer D, med et totalt elutionvolum på 5 CV. Samle denne fraksjonen i samlerrørene. Vasketrinn 3: Elute alle sterkt interagerende forurensninger ved hjelp av 100% buffer D med et totalt volum på 5 CV. Analyser absorpsjonsspekteret for prøvefraksjonen ved 260 eller 280 nM (figur 4). Den første toppen viser de ikke-absorberte proteinene som ble eluted under lasting og det første vasketrinnet; Den andre toppen viser forurensninger som har blitt unngått i løpet av det andre vasketrinnet. Den tredje toppen overvåker sluttproduktet, og den siste toppen viser de sterkt interagerende forurensningene. Samle alle utvalgsfraksjoner som tilsvarer den tredje toppen for videre behandling. Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid. Legg den gjenvunne fraksjonen forsiktig over på 15 ml av putebufferen i fire ultrasentrifugasjonsrør av polykarbonat. Tilsett maksimalt 15 ml av prøven til 15 ml av putebufferen. Sørg for å balansere vekten av røret godt. Pellet ribosomene ved ultracentrifugation ved 100000 x g ved 4 °C i 16 timer.MERK: Pass på at det ikke er sprekker i ultracentrifugation rørene. Rengjør og tilbakestill kolonnen på følgende måte. En strømningshastighet på 5 ml/min fungerer bra. Plasser alle innløpene i vannet og utfør en pumpevask. Vask kolonnen med 2 CV vann. Plasser innløpet i en 0,5 M NaOH-løsning, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen med 3 CV naoh. Plasser innløpet i vann, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen i 2 CV vann. Plasser innløpet til en 0,1 M eddiksyreoppløsning, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen med 3 CV eddiksyreoppløsning. Pump vask og vask kolonnen med 2 CV vann. Plasser alle innløp i 20% ((v/ v)) etanol, utfør et pumpevasktrinn og oppbevar kolonnen i 20% ((v / v)) etanol ved å vaske den med 3 CV av en 20% ((v / v)) etanolløsning.MERK: Sørg for at systemet aldri går tørt eller suger inn luft. Bruk aldri buffer direkte på etanol eller etanol på bufferen. Legg alltid til et vannvasktrinn i mellom, da det ellers er fare for at utfellinger tetter kolonnen. Sørg for å legge til nok prøveoppsamlingsrør. Dag 5: Kast den supernatante og forsiktig, uten å forstyrre den gjennomsiktige pelletsen, vask hver pellets med 0,5 ml iskald ribosomebuffer. Gjenta dette trinnet to ganger. Resuspend hver av de klare pellets i 100 μL ribosole buffer på is ved hjelp av en magnetisk rørestang (3 mM diameter, 10 mM lengde) på en magnetisk rører ved hjelp av lavest mulig hastighet. Samle de resuspended ribosomer og vask rørene med ytterligere 50 μL ribosombuffer.MERK: Den gjennomskinnelige pelletsen er vanskelig å se. Vask derfor pelletsen forsiktig fra sidene av røret. Bestem ribosomkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nM av prøven fortynnet med et forhold på 1:100 i ribosombuffer. En absorbans på 10 av den fortynnede løsningen tilsvarer 23 μM ufortynnet løsning som tidligere beskrevet16. Implementer en endelig lagerkonsentrasjon på 10 μM. For å justere konsentrasjonen, fortynn ribosomene med ribosomebuffer eller konsentrer dem videre ved sentrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa sentrifugalfilter ved 4 °C.MERK: For å oppnå optimalt systemuttrykk, utfør ribosomtitrering (pkt. 5.2, supplerende tabell 7). Kontroller ribosomesammensetningen med SDS-PAGE (figur 3A) som angitt i avsnitt 1.3.3. Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer, og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene til gelen. 4. Energiløsning MERK: Sammensetningen for 2,5x energiløsning introdusert her er et eksempel på en løsning som fungerte bra for en standard TX-TL-reaksjon. For å optimalisere timingen, forberede energiløsningen i løpet av dag 2. Utarbeidelsen av aminosyreoppløsningen forklares i detalj, etterfulgt av den endelige forberedelsesprosedyren. AminosyreoppløsningMERK: Klargjør aminosyreoppløsningen i bulk. Forberedelse av mengden aminosyre lagerløsninger som kreves for et sluttvolum på minst 2000 μL, vil redusere veiefeilen for de ellers svært små mengdene. Den totale konsentrasjonen av aminosyreoppløsningen er begrenset av løseligheten av aminosyrene og de respektive lagerløsningskonsentrasjonene. For standard PURE-systemet, lag en løsning med en endelig konsentrasjon på 3,25 mM. Bruk beregningstabellen for aminosyreoppløsningen (Supplerende tabell 3) som mal. Bruk cystein i saltform for å sikre tilstrekkelig løselighet. Unngå å bruke KOH-baserte aminosyreforberedelsesmetoder. Det er mulig å direkte veie de nøyaktige mengdene aminosyrer inn i den endelige aminosyreoppløsningen uten å forberede lagerløsning for alle aminosyrene. Dette er imidlertid mer utfordrende og mindre presist. Forbered lagerløsninger for hver aminosyre som beskrevet i supplerende tabell 3, med unntak av Tyrosin.MERK: På grunn av de forskjellige løselighetene til aminosyrene i vann, varierer de respektive foreslåtte konsentrasjonene av lagerløsningen. Minimal masse [mg] gir den omtrentlige minimumsmassen som kreves for å oppnå en tilstrekkelig mengde lagerløsning for målvolumet, som referanse.MERK: Den minimale massen beregnes med et overskudd på 10%. For en enklere forberedelse av løsningene, ikke vei den nøyaktige mengden aminosyre, men i stedet, for den aktuelle massen, juster mengden vann for å oppnå ønsket konsentrasjon. Beregn mengden deionisert vann (Vann for å legge til [μL]) som trengs, basert på den faktiske massen som er fylt ut (lysegule celler) og ønsket konsentrasjon ved hjelp av regnearket i Supplerende tabell 3. Solubiliser aminosyrebestandsløsningene ved å virvelere til alt bunnfall er oppløst. De enkelte aminosyrebestandsløsningene kan lagres ved -20 °C i flere uker.MERK: Noen aminosyrer er vanskelige å oppløse i vann; prosessen kan ta litt tid. Vei den nøyaktige mengden tyrosin som kreves for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3,25 mM direkte inn i røret for aminosyreoppløsningen.MERK: Tyrosin er svært vanskelig å oppløse i vann. Legg den til direkte i stedet for å forberede en lagerløsning. Tilsett de tilsvarende mengdene aminosyre lagerløsninger og vann som angitt i det endelige volumet for å legge til [μL] kolonne (lyseblå celler) og virvel løsningen godt. Oppbevar den ferdige aminosyreoppløsningen ved -80 °C inntil videre bruk. Forberedelse av energiløsningenMERK: Totalt inneholder 2,5x energioppløsning 0,75 mM av hver aminosyre, 29,5 mM magnesiumacetat, 250 mM kaliumglutamat, 5 mM ATP og GTP hver, 2,5 mM CTP, UTP og TCEP, henholdsvis 8,75 mg/ml tRNA fra E. coli MRE 600, 50 mM kreatinfosfat, 0,05 mM folinsyre, 5 mM spermidin og 125 mM HEPES. Førstegangsbrukere klargjør energiløsningen i små grupper på 200 μL. Oppbevar de enkelte løsningene som er tilberedt i henhold til supplerende tabell 4 ved -20 °C eller -80 °C til senere bruk. Tine alle vandige løsninger som er nevnt i supplerende tabell 5 på is. I mellomtiden klargjør du lagerløsningene for de resterende komponentene som er oppført i Supplerende tabell 4. Hold alle løsningene på is etter tilberedning.MERK: Tilsett 500 μL RNase- og DNase-fritt vann direkte til hetteglasset for å løse opp de lyofiliserte tRNAene. Bland godt ved skånsom virveling; begrense pipettering for å unngå å introdusere RNases. Tilsett de beregnede volumene (Supplementary Table 5) med lagerløsninger og vann og bland godt ved hjelp av en virvel. Hold løsningen på is til enhver tid. Mål pH i oppløsningen ved å pipettere 1 μL på en pH-stripe, for å sikre at pH i løsningen er nøytral. Aliquot energiløsningen ved 50-100 μL per rør på is og oppbevar ved -80 °C til videre bruk. Mens aliquoting, virvel hovedbestanden ofte for å hindre komponentene fra å utfelle.MERK: Eventuelt gjennomføre en aktivitetsanalyse av den nylagde energiløsningen mot kommersielle energiløsninger, for eksempel løsning A i PURExpress. Hvis en betydelig lavere ytelse av systemet med energiløsningen observeres, kan optimalisering av ionkonsentrasjonene, spesielt magnesiumioner, ved titrering (5-20 mM) være fordelaktig. 5. OnePot PURE reaksjon DNA-malMERK: Proteiner kodet nedstrøms for T7-promotoren kan uttrykkes i PURE fra enten lineært eller sirkulært DNA. Ved å generere en lineær DNA-mal ved hjelp av utvidelsen PCR, kan kjedelige kloningstrinn utelates. De lineære malene for denne studien ble generert av PCR som beskrevet nedenfor, ved hjelp av en DNA-polymerase med høy kvalitet (Materialfortegnelser). Primersekvenser, smeltetemperaturer og termosirkuleringsinnstillingene som brukes i denne studien, er angitt i Supplerende tabell 6. Utarbeidelsen av DNA-malen er ikke inkludert i den daglige tidsplanen. Sett opp en PCR-reaksjon som anbefalt av polymeraseleverandøren.MERK: Optimaliserte parametere for en DNA-polymerase med høy gjengivelse (Materialfortegnelser) er gitt i supplerende tabell 6. Forsterke målgenet (f.eks. eGFP) som en lineær mal fra en plasmid eller et genom ved hjelp av genspesifikke primere (500 nM) (for parametrene, se Supplerende tabell 6). Forsterkningen genererer korte utvidelser for å gi glødsekvenser for følgende utvidelse PCR-trinn. Kontroller amplikonen på en agarosegel for riktig størrelse og renhet. Bruk det forsterkede DNA-et som mal for de påfølgende forlengelsestrinnene. Sett opp en reaksjon på minst 50 μL. Kjør 10 PCR-forsterkningssykluser med forlengelsesprimerne (2,5 nM). Etter å ha fullført forsterkningssyklusene, legg umiddelbart de endelige primerne (500 nM) til samme reaksjon og kjør 30 sykluser for å forsterke det utvidede PCR-produktet. Finn smeltetemperaturer og primersekvenser i Supplerende tabell 6. Rens DNA-fragmentene ved hjelp av et DNA-rensesett og elute DNA i nukleasefritt vann i stedet for EDTA som inneholder elutionbuffer. Kontroller den lineære malen på en agarosegel for riktig størrelse og renhet. Mål DNA-konsentrasjonen i ng/μL ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer. Sette opp PURE-reaksjonenMERK: Den endelige reaksjonssammensetningen er 1x energiløsning, tagfrie ribosomer eller his-tag ribosomer, OnePot PURE-proteiner og DNA-mal. Reaksjonsvolumforholdet består av 40% energiløsning, 30% protein- og ribosomløsning og 30% DNA og vann. Typiske reaksjonsvolumer varierer mellom 5 μL og 25 μL. Kvantifisere uttrykket av et fluorescerende protein kontinuerlig på en plateleser. Bruk et grønt lys in vitro Oversettelsesmerkingssystem, som inkorporerer fluorescerende merket Lysine rester i nylig syntetiserte proteiner, for å verifisere uttrykket av ikke-fluorescerende proteiner på en SDS-PAGE gel. Et eksempel på en reaksjonsmal er angitt i Supplerende tabell 7 for å bidra til å etablere en PURE cellefri uttrykksreaksjon. Celler i gult indikerer brukerinndataverdier, og celler i oransje indikerer flere reagenser som eventuelt skal legges til reaksjonen. Hold volumforholdene til komponentene presise for å sikre riktig ionbalanse. For eksempel, for å oppnå en høyere proteinkonsentrasjon, øke OnePot proteinløsningskonsentrasjonen; Men ikke øk volumet av proteinoppløsning lagt til reaksjonen.Fyll ut konsentrasjonen [ng/μL] og lengden [basepar] av DNA i de tilsvarende gule cellene i regnearket. Bruk 2-10 nM DNA for reaksjonen. Fyll ut ønsket totalreaksjonsvolum i μL. Fjern de nødvendige reagensene fra fryseren og tine dem på is.MERK: Det er mulig å fryse komponentene på nytt uten at funksjonaliteten reduseres. Minimer imidlertid antall fryse-tine sykluser og tidsprøver lagres på is så mye som mulig. Pipette de beregnede mengdene vann, DNA og energiløsning på den ene siden av PCR-røret eller et hjørne av en brønn på 384-brønnsplaten. Tilsett den nødvendige mengden ekstra reagens på samme side. Minimer antall prøver per eksperiment for å unngå prøvefordampning og eksperimentell starttidsbias.MERK: Det er avgjørende å holde energikomponenten fysisk adskilt fra proteinkomponentene for å unngå for tidlig forbruk av energikildene og lavere utbytter. Pipette de beregnede mengdene protein og ribosomløsning til den andre siden av et PCR-rør eller motsatt hjørne av 384-brønnsplaten.MERK: Bruk hovedblandinger når det er mulig for å redusere virkningen av pipetteringsfeil. Etter første testing kan ribosomet og proteinløsningene blandes og lagres som en løsning. Snurr i en kort periode (30 s) for å slå sammen reaksjonskomponentene. For å unngå fordampning under platelesereksperimenter, tilsett 35 μL flytende voks og forsegle platen med et gjennomsiktig tetningsmiddel (se Materialbord). Inkuber i minst 3 timer ved 37 °C. For avlesning på en plateleser, mål fluorescensintensiteten ved ønsket bølgelengde hvert 2. Utfør følgende trinn for Green Lys-merkede prøver. Etter det cellefrie uttrykket inkuberer du prøven med 0,16 μg/μL RNase A i 30 minutter ved 37 °C for å fjerne den fluorescerende bakgrunnen til Green Lys-merkingssettet.MERK: Bruk RNase A, da andre typer RNases ikke fjerner bakgrunnen tilstrekkelig godt. Visualiser proteinuttrykket ved å kjøre SDS-PAGE som angitt i avsnitt 1.3.3. Vask den unstained gelen forsiktig i deionisert vann, og bilde den på en fluorescerende imager ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm. Deretter flekker gelen ved hjelp av konvensjonelle Coomassie fargingsmetoder. For passende parametere se pkt. 1.3.3.MERK: Utfør en titrering av proteinoppløsningen med den anbefalte ribosolekonsentrasjonen og, om nødvendig, titrat ribosomer med den optimale OnePot-proteinkonsentrasjonen etterpå. Bruk det kommersielle PURExpress ΔRibosome-settet som en positiv kontroll. Løsning A, faktorblanding og ribosomeoppløsningen tilsvarer henholdsvis den tilberedte energien, OnePot-proteinløsningen og de rensede ribosomene.