OBS: Detta protokoll beskriver beredningen av cellfria TX-TL-system från rekombinanta komponenter. För enkelhetens skull är arbetet uppdelat i fem delar. Den första delen beskriver förberedelsesteg, vilket bör göras innan protokollet startas. Den andra delen beskriver beredningen av OnePot-proteinlösningen. Den tredje delen beskriver ribosomreningsningar, den fjärde delen beskriver beredningen av energilösningen och den sista delen ger en handbok för att ställa in en PURE-reaktion. För enkelhetens skull är protokollen indelade i dagar och sammanfattas i dagliga scheman i tabell 1. Efter schemat kan hela systemet förberedas på 1 vecka av en person. 1. Preliminärt arbete Förbered bakteriekulturmedierna och medietillskotten enligt beskrivningen i tilläggstabell 1. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, 96 djupbrunnplattor. Stamberedning Omvandla de uttrycksstammar som anges i tabell 2 med motsvarande uttrycksvektorer med hjälp av värmechockmetoden. Tillsätt renad plasmid till de kemiskt kompetenta bakterierna och inkubera på is i 20-30 min. Placera blandningen vid 42 °C i 30 s (värmechock) och lägg den sedan tillbaka på is i 2 minuter. Pipettera 20 μL av bakterierna direkt på agarplattor som innehåller ampicillin (AMP) och inkubera vid 37 °C över natten. Förvara plattorna vid 4 °C i upp till 1 vecka. Inokulera 3 ml LB-media som innehåller AMP med en enda koloni av bakterier från agarplattorna. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten. Blanda 250 μL av odlingen med 250 μL 50% (v/v) glycerol och förvara vid -80 °C.OBS: För snabbare beredning i framtiden, lagra stammarna i en 96-brunnsplatta samt glycerol lager. Bekräfta alla vektoromvandningar genom koloni PCR och sekvensering. Sekvens genen, promotorregionen och ribosombindningsstället. Uttryckstest Inokulera 300 μL LB-medium innehållande AMP med cirka 1 μL av de beredda glycerollagren i en djupbrunnstallrik på 1,3 ml. Försegla plattan med ett membran som andas och inkubera sedan vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten.OBS: Alla uttryck görs separat vid denna tidpunkt. Inokulera 300 μL färska LB-medier som innehåller AMP med 1 μL av de nattliga kulturerna. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten. Efter 2 h, inducera cellerna med 100 μM Isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) och växa i ytterligare 3 timmar. Blanda 10 μL av kulturen med 10 μL 2x Laemmli buffert och värm till 95 °C i 10 min. Snurra proverna i 1 min med en bordscentrifuger och lasta 10 μL av supernatanten på en PAGE-gel. Kör gelén i Tris/Glycine/SDS buffert vid 200 V i 30 min. Skölj det väl med avjoniserat vatten. Täck gelén med en Coomassie proteinfläck och inkubera i 1 h. Avstå gelén i vatten vid behov (representativa resultat för uttryckstestet i figur 1).OBS: Använd gradient (4%-15% eller 4%-20%) PAGE geler för att uppnå en bra separation. Restaurering och rengöring av IMAC Sepharose harts Förberedelse av pelare. Blanda Sepharose-hartset väl genom att virvla. Pipettera den erforderliga mängden harts i en tom gravitationsflödeskolonn.OBS: Mängden harts som krävs varierar mellan his-ribosomrening och proteinrening och specificeras i respektive avsnitt. Tvätta hartset med 30 ml avjoniserat vatten. Fortsätt med kolumnreladdning enligt avsnitt 1.4.4.OBS: Låt alltid all vätska passera genom kolonnen innan du fortsätter med nästa steg. Se dock till att kolonnen aldrig blir torr. När du kör någon vätska genom kolonnen, se till att stoppa flödet eller fortsätt till nästa steg så snart vätskan når hartset. Återställning. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten. Applicera 10 ml 0,2 M EDTA och 0,5 M NaCl-lösning. Tillsätt 30 ml av en 0,5 M NaCl-lösning. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten. Förvara i 20% (v/v) etanol vid 4 °C eller fortsätt med nästa steg. Rengöring.VARNING: Använd skyddsutrustning. Tvätta kolonnen med 30 ml 0,5 M NaOH. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten. Tvätta kolonnen med 30 ml 0,1 M ättiksyra. Tvätta kolonnen med 30 ml avjoniserat vatten. Tvätta kolonnen med 30 ml 70% (v/v) etanol. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten. Förvara i 20% (v/v) etanol vid 4 °C eller fortsätt med nästa steg. Laddas om. Tillsätt 10 ml 0,1 M nickelsulfatlösning till kolonnen.VARNING: Nickelsulfat är giftigt. Nickelsulfatavfall måste kasseras med de försiktighetsåtgärder som anges av leverantören. Tvätta kolonnen med 50 ml avjoniserat vatten. Förvara i 20% (v/v)) etanol vid 4 °C eller fortsätt med kolonnkvilibration.OBS: Om kolonnen förvaras i etanol mellan stegen, se till att ta bort alla spår av etanol genom att tvätta kolonnen med vatten. 2. OnePot proteinlösning uttryck och rening OBS: Protokollet består av tre delar indelade i dagar (figur 2). Ett idealiskt beredningsförfarande producerar 1,5 ml 13,5 mg/ml OnePot-proteinlösning, vilket motsvarar mer än tusen 10 μL PURE-reaktioner. Mängden och den idealiska koncentrationen av lösningen varierar dock från parti till parti. Erfarna användare kan utföra flera OnePot PURE-förberedelser åt gången. Dag 1: Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, två 96 djupbrunnplattor och en 1 L förbryllad Erlenmeyerkolv. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C. Komplettera alla buffertar med 1 mM TCEP precis före användning, om inget annat anges. Använd 2 ml sefarosharts för OnePot-proteinrening. Förbered kolumnen enligt beskrivningen i avsnitt 1.4. För att förbereda startkulturerna, kombinera 20 ml LB-media med 20 μL AMP. Tillsätt 300 μL av mediet i 35 brunnar i en steril 96, 1,3 ml djupbrunnstallrik. Inokulera var och en av dem med sin respektive stam, förutom töjningsfaktor termo instabil (EF-Tu), och försegla plattan med ett andningsbart membran.OBS: Inokulera plattan med en 96-brunnsreplikator (se Materialtabell). Brunnsvolymen på djupbrunnplattan och startkulturens volym är väsentliga. Större medievolymer eller mindre brunnsvolymer kommer att leda till en annan bakterietäthet på grund av inkonsekvenser i inkonsekvenser. För EF-Tu-kulturen, inokulera 3 ml LB-media i ett 14 ml kulturrör med en snap cap. En enda 3 ml kultur för EF-Tu är tillräcklig för en OnePot uttryckskultur. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min över natten. Dag 2:OBS: Utför alla steg i rumstemperatur om inget annat anges. Överför 500 ml LB-media och 500 μL AMP till den sterila förbryllade kolven. Inokulera OnePot PURE-kulturen med 1675 μL EF-Tu-kulturen och 55 μL av var och en av kulturerna från djupbrunnstallriken(tabell 2).OBS: Under detta steg kan den totala proteinsammansättningen justeras genom att justera inokuleringsförhållandena. Se till att den totala inokuleringsvolymen förblir konstant vid 3,6 ml.VALFRITT: För att bekräfta att alla stammar har vuxit över natten, mät den optiska densiteten hos nattkulturerna till 600 nM (OD600)i en 96-brunnsplatta med en plattläsare. Använd en utspädning på 10x för mätning av optisk densitet. Inkubera kulturen i 2 timmar vid 37 °C med en skakning på 260 varv/min, eller tills kulturens OD600 når 0,2-0,3. Inducera kulturen med 500 μL 0,1 mM IPTG och växa i ytterligare 3 timmar. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4 °C och 3220 x g i 10 minuter och förvara cellpelleten vid -80 °C tills vidare.OBS: För att optimera tidpunkten, förbered den energilösning som beskrivs i avsnitt 4 under inkubationstiden dag 2(tabell 1). Dag 3: Mät de mängder buffertar som behövs för reningen som beskrivs i stegen nedan och tillsätt TCEP till dem alla enligt tilläggstabell 2. Förvara de återstående buffertarna utan TCEP vid 4 °C för framtida reningar. Balansera den laddade kolumnen (avsnitt 2.4) med 30 ml buffert A. När 25 ml buffert A har passerat stänger du kolumnen nedifrån. Parallellt fortsätter du med steg 2.15-2.17. Tina cellerna och använd en serologisk pipett för att återanvända cellpelleten i 7,5 ml buffert A. Lyse cellerna med hjälp av en 130-watt sond sonicator (se Tabell över material, sondspetsdiameter: 6 mm) med följande parametrar: 4 x 20 s puls på, 20 s puls av, 70% amplitud. Om ultraljudsbehandlingen lyckas blir lösningen mörkare (bild 2).OBS: Se till att hålla cellerna på is under ultraljudsbehandling. Placera sonden tillräckligt djupt i lösningen utan att vidröra röret. Om en stor mängd skum genereras dämpas energiöverföringen. Låt i så fall skummet sätta sig, sänka sonden djupare in i lösningen och förlänga ultraljudsbehandlingstiden. Ta bort cellskrotet genom centrifugering vid 21130 x g i 20 min vid 4 °C omedelbart efter ultraljudsbehandling. Håll lysat på is. Lägg till supernatanten i den ekvilibrerade kolumnen. Stäng kolonnen uppifrån och se till att det inte finns något läckage. Inkubera kolonnen i 3 h vid 4 °C under rotation med hjälp av en rörrotator. Elute obundna komponenter från kolonnen och tvätta med 25 ml buffert A. Tvätta kolonnen med 25 ml 25 mM imidazolbuffert (23,95 ml buffert A och 1,25 ml buffert B). Elute proteinerna med 5 ml 450 mM imidazolbuffert (0,5 ml buffert A och 4,5 ml buffert B). Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden. Späd eluatet med 25 ml HT-buffert, håll blandningen på is. Tillsätt 15 ml till ett 15 ml centrifugalfilter och koncentrera dig till en volym av 1,5 ml. Tillsätt de återstående 15 ml till filtret med den koncentrerade lösningen och koncentrera dig till 1,5 ml igen. Tillsätt 10 ml HT-buffert till det koncentrerade provet och koncentrera till 1 ml. Tillsätt lika mycket lagerbuffert B och förvara vid -80 °C tills vidare.OBS: En omgång utbyte/koncentration tar ca 60 min spinning vid 3220 x g vid 4 °C. Återställ kolumnen enligt avsnitt 1.4 under buffertutbytet. Dag 4: Mät proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-analysen enligt leverantörens beskrivna. Koncentrera provet med ett 0,5 ml 3 kDa cutoff centrifugalfilter till 20 mg/ml.OBS: Späd ut proteinlösningen 25 gånger eller 50 gånger före koncentrationsmätningarna för att undvika övermättnad av Bradford-analysen. För att fastställa den ideala proteinkoncentrationen, utför ett uttryckstest i detta skede (avsnitt 5.2) med olika koncentrationer av proteinlösningen. För att utföra titreringen, håll den totala volymen av lösningen konstant och pipetten OnePot proteinlösningen, inklusive lagerbuffert B, vid fem olika förhållanden(kompletterande tabell 7). Kontrollera OnePot PURE-proteinkompositionen med SDS-PAGE (bild 3A). Späd ut 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna till gelén. Kör SDS-PAGE enligt avsnitt 1.3.3. Aliquot proteinlösningen i 50 μL alikvoter efter att ha verifierat uttrycket och justerat koncentrationen. Förvara OnePot PURE-proteinlösningen vid -80 °C tills vidare användning.OBS: Om en proteinkomponent misstänks inte finnas eller finns i en lägre koncentration än förväntat i OnePot PURE, utför följande steg. Kontrollera om respektive stams nattkultur har vuxit i jämförbar takt med de andra kulturerna genom att utföra optiska densitetsmätningar (OD600)av alla kulturer. Utför ytterligare ett uttryckstest av den specifika stammen för att verifiera uttrycket av det misstänkta proteinet. 3. Ribosomlösning OBS: Två olika ribosomreningsstrategier införs, en för hexahistidinmärkt och en för icke-taggade ribosomer. Den stora fördelen med reningsmetoden med hisrening på en standard affinitet Ni-NTA gravitation flöde kolumn är att reningen är enkel, snabb och inte kräver ytterligare laboratorieutrustning, såsom ett FPLC-system och en ultracentrifuge. Proteinproduktionskapaciteten i OnePot PURE-reaktioner är dock cirka en tredjedel jämfört med taggfria ribosomer. Välj därför metoden för ribosomproduktion baserat på om ett högt utbyte är viktigt för den givna applikationen. His-märkt ribosom reningOBS: Detta protokoll använder E. coli RB1-stammen, en gåva från professor Wang (Columbia University, USA)18. Denna stam har en genomisk insättning av en hexahistidin tagg på C ändstationen av 50S ribosomal protein (L7/L12), vilket möjliggör rening med hjälp av en Ni-NTA gravitation-flöde kolumn. Den vanliga avkastningen är cirka 0,5 ml 3,45 μM ribosomer, vilket är tillräckligt för mer än femhundra 10 μL PURE-reaktioner. Dag 1: Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, en 5 L Erlenmeyerkolv och en 100 ml Erlenmeyerkolv. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C. Dag 2: Pipettera 5 ml harts till en pelare och förbered kolonnen enligt punkt 1.4.OBS: På grund av hartsets högre volym tar restaureringen och reningen betydligt längre tid. Använd en annan kolumn för ribosomrening för att undvika korskontaminering och rengör den noggrant före reningen. Förbered en nattlig kultur av E. coli RB1-stammen genom att inokurera 35 ml LB-media i en 100 mL Erlenmeyer-kolv. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min. Dag 3:OBS: Utför alla steg i rumstemperatur om inget annat anges. Tillsätt 2 L LB-media i en 5 L steril kolv, inokulera med 12 ml över nattens kultur och inkubera sedan i 3-4 timmar vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min.OBS: Alternativt, utföra bakteriell odling i 4 x 500 ml kulturer i 1 L förbryllade flaskor. Pellet cellerna genom centrifugering i 10 min vid 3220 x g och 4 °C. Förvara vid -80 °C tills vidare användning. Dag 4: Balansera den kolumn som bereds i steg 3.1.4. med 30 ml lysbuffert. Återanvänd pelleten i 20 ml lysbuffert med hjälp av en serologisk pipett. Lyse cellerna med en 130-watt sond sonicator (se Tabell över material, sondspetsdiameter: 6 mm) på is med följande parametrar: 11 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitud (se steg 2.16 för procedurdetaljer). Omedelbart efter ultraljudsbehandling, ta bort cellrester genom centrifugering i 20 min vid 21130 x g vid 4 °C. Håll lysat på is. Ladda supernatanten till kolumnerna och låt den passera igenom. Tvätta kolonnen med följande blandningar av lys- och elutionsbuffertar. Tvätt 0: Använd 30 ml lysbuffert. Tvätt 1: använd 30 ml 5 mM imidazol (29 ml lysbuffert, 1 ml elutionsbuffert). Tvätt 2: använd 60 ml 25 mM imidazol (50 ml lysbuffert, 10 ml elutionsbuffert). Tvätt 3: använd 30 ml 40 mM imidazol (22 ml lysbuffert, 8 ml elutionsbuffert). Tvätt 4: använd 30 ml 60 mM imidazol (18 ml lysbuffert, 12 ml elutionsbuffert). Elute ribosomerna med 7,5 ml elutionbufferten. Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden. Tillsätt 22 μL ren β-mercaptoethanol till 45 ml ribosombuffert.VARNING: β-mercaptoethanol är giftigt. Vidta säkerhetsåtgärder och arbeta i en rökhuv. Tillsätt eluatet till ett 15 ml centrifugalfilter och koncentrera till 1 ml. Tillsätt 15 ml ribosombuffert till det koncentrerade provet och koncentrera dig igen till 1 ml.OBS: Upprepa föregående steg två gånger. Förvara vid -80 °C tills vidare användning.OBS: En omgång utbyte/koncentration tar ca 60 min centrifugering vid 3220 x g vid 4 °C. Återställ kolumnen enligt avsnitt 1.4 under buffertutbytet. Dag 5: Bestäm ribosomkoncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nM av ett prov utspädd 1:100 i ribosombuffert. Absorbansvärdet 10 av den utspädda lösningen motsvarar 23 μM outspädd lösning enligt tidigare beskrivna16. Implementera en slutlig lagerkoncentration på 3,45 μM. För att justera koncentrationen, späd ribosomerna med ribosombuffert eller koncentrera dem ytterligare genom centrifugering vid 14000 x g i ett 3 kDa 0,5 ml centrifugalfilter vid 4 °C.OBS: För att uppnå ett optimalt systemuttryck, utför en ribosomkoncentrationstitrering (avsnitt 5.2, tilläggstabell 7). Kontrollera ribosomkompositionen med SDS-PAGE(bild 3A)enligt punkt 1.3.3. Späd 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna på gelén. Taggfri ribosomreningOBS: Taggfri ribosomrening utförs med hjälp av ett FPLC-system(Table of Materials) och baseras på hydrofobisk interaktionskromatografi med 2 x 5 ml Butylkolumner(Tabell över material). Även om ribosomer kan renas från vilken stam som helst, är det fördelaktigt att använda E. coli A19 (E. coli Genetic Resources at Yale CGSC) på grund av dess RNase I borttagning22. Utför reningen vid 4 °C i antingen ett kylrum eller ett kylskåp. Den vanliga avkastningen är cirka 0,5 ml 10 μM ribosomer, vilket motsvarar mer än femhundra 10 μL PURE-reaktioner. Dag 1: Förbered bakteriekulturmedier och medietillskott enligt beskrivningen i tilläggstabell 1. Förbered och sterilisera de material som krävs, inklusive pipettspetsar, 5 L Erlenmeyerkolv och 100 ml Erlenmeyerkolv. Upprätta buffertar och tillägg enligt beskrivningen i tilläggstabell 2. Filtrera sterilisera alla buffertar med hjälp av flaskfilter (0,45 μm) och förvara dem vid 4 °C. Dag 2: För att förbereda en nattkultur av E. coli A19-stammen, inokulera 35 ml LB-media i en 100 ml Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 260 varv/min. Dag 3: Överför 2 L LB-media till den 5 L sterila förbrytna kolven, inokulera med 30 ml av nattkulturen och inkubera sedan i 3-4 timmar vid 37 °C medan du skakar vid 200 varv/min. Pellet cellerna genom centrifugering vid 4000 x g i 15 min vid 4 °C. Återanvänd pelleten i 25 ml suspensionsbuffert och förvara vid -80 °C tills vidare. Dag 4: Utför steg 3.2.8-3.2.12 parallellt med steg 3.2.13-3.2.19. Tina och lysera cellerna med hjälp av en 130-wattssond sonicator (se Tabell över material och sondspetsdiameter: 6 mm) på is med följande parametrar: 12 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitud (se steg 2.16 procedurdetaljer). Avlägsna omedelbart cellskräpet genom centrifugering vid 20000 x g i 20 min vid 4 °C. Aspirera supernatanten och mät volymen. Tillsätt en lika stor mängd suspensionsbuffert (högt salt) för att justera den slutliga koncentrationen av ammoniumsulfat till 1,5 M och blanda väl. Ta bort fällningen genom centrifugering vid 20000 x g i 20 min vid 4 °C. Filtrera supernatanten med hjälp av ett 0,45 μm polyetersulfonmembransprutfilter före FPLC-rening och samla filtratet i en 100 ml glasflaska. Håll supernatanten vid 4 °C hela tiden. Ställ in FPLC-systemet för hydrofobisk interaktionskromatografirening med en dubbel Butylkolonn (2 x 5 ml) enligt följande. För den här inställningen refererar en kolumnvolym (CV) till en volym på 10 ml. Tre inlopp kommer att behövas: två som buffertlinjer och en som exempellinje. På grund av renarens standardinställningar är det bekvämt att välja linjerna A1 och B1 för buffert C respektive buffert D och linje A2 som exempellinje. Applicera ett standardflöde på 4 ml/min, med undantag för pumptvättar (10 ml/min) eller om inget annat anges.OBS: Eftersom TCEP är ett kostsamt reagens lägger du till motsvarande belopp till buffertarna C och D först efter jämviktssteget. Utför en systempumptvätt i 20% (v/v)) etanol för att rengöra systemet och avlägsna potentiell förorening från tidigare reningar. Ställ in ett flödeshastighet på 0,2 mL/min manuellt och montera kolonnen. Stoppa flödet. Utför en systempumptvätt med vatten. Tvätta kolonnen med 3 CV vatten. Jämvikt: placera inloppen A1 och A2 i buffert C och inlopp B1 i buffert D utan TCEP. Utför en pumptvätt och balansera kolonnen med 4 CV buffert C. Lägg till TCEP i buffertarna C och D. Förbered 15 ml rör eller rensa runda fraktionssamlarrör till fraktionssamlaren för att samla 4-5 ml elutionsfraktioner. Lastning: Placera inloppet A2 i flaskan med det filtrerade provet. Läs in cirka 90 % av exempelvolymen på kolumnen. Späd ut provet med 20 ml TCEP-innehållande buffert C och lasta 10 ml av provet på kolonnen. Upprepa utspädningssteget minst två gånger och ladda så mycket prov på kolonnen som möjligt. Det är viktigt att se till att ingen luft sugs in i maskinen. Tvätt steg 1: tvätta med 3 CV buffert C för att ta bort de obundna komponenterna. Tvätt steg 2: tvätta med 5 CV av 80% buffert C och 20% buffert D. Elution: elutera produkten genom att applicera 50% av buffert C och 50% av buffert D, med en total elutionsvolym på 5 CV. Samla in denna fraktion i uppsamlarrören. Tvätt steg 3: Elute alla starkt interagerande föroreningar med 100% buffert D med en total volym på 5 CV. Analysera provfraktionens absorptionsspektrum vid 260 eller 280 nM (figur 4). Den första toppen visar de icke-absorberade proteinerna som eluteras under lastning och det första tvättsteget; den andra toppen visar föroreningar som har eluterats under det andra tvättsteget. Den tredje toppen övervakar slutprodukten, och den sista toppen visar de starkt interagerande föroreningarna. Poola alla provfraktioner som motsvarar den tredje toppen för vidare bearbetning. Håll de eluterade proteinerna på is hela tiden. Lägg försiktigt över den återvunna fraktionen på 15 ml av kuddebufferten i fyra ultracentrifugationsrör med polykarbonat. Tillsätt högst 15 ml av provet till 15 ml av kuddbufferten. Se till att balansera rörets vikt väl. Pellet ribosomerna genom ultracentrifugation vid 100000 x g vid 4 °C i 16 timmar.OBS: Se till att det inte finns några sprickor i ultracentrifugeringsrören. Rengör och återställ kolumnen enligt följande. Ett flöde på 5 ml/min fungerar bra. Placera alla inlopp i vattnet och utför en pumptvätt. Tvätta kolonnen med 2 CV vatten. Placera inloppet i en 0,5 M NaOH-lösning, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen med 3 CV NaOH. Placera inloppet i vatten, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen i 2 CV vatten. Placera inloppet till en 0,1 M ättiksyralösning, utför en pumptvätt och tvätta sedan kolonnen med 3 CV ättiksyralösning. Pumpa och tvätta kolonnen med 2 CV vatten. Placera alla inlopp i 20% (v/v)) etanol, utför ett pumptvättsteg och förvara kolonnen i 20% (v/v)) etanol genom att tvätta den med 3 CV av en 20% (v/v)) etanollösning.OBS: Se till att systemet aldrig torkar eller suger in luft. Applicera aldrig buffert direkt på etanol eller etanol på buffert. Tillsätt alltid ett vattentvättsteg däremellan, eftersom det annars finns risk för fällningar som täpper till kolonnen. Se till att lägga till tillräckligt med provsamlingsrör. Dag 5: Kassera supernatanten och tvätta varje pellet utan att störa den genomskinliga pelleten med 0,5 ml iskall ribosombuffert. Upprepa det här steget två gånger. Återsuspend var och en av de klara pelletsen i 100 μL ribosombuffert på is med hjälp av en magnetisk omrörning (3 mM diameter, 10 mM längd) på en magnetisk omrörare med lägsta möjliga hastighet. Samla upp de återanvända ribosomerna och tvätta rören med ytterligare 50 μL ribosombuffert.OBS: Den genomskinliga pelleten är svår att se. Tvätta därför försiktigt pelleten från rörets sidor. Bestäm ribosomkoncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 nM av provet utspädd med ett förhållande av 1:100 i ribosombuffert. En absorbans på 10 av den utspädda lösningen motsvarar 23 μM outspädd lösning enligt beskrivningen16. Implementera en slutlig lagerkoncentration på 10 μM. För att justera koncentrationen, späd ribosomerna med ribosombuffert eller koncentrera dem ytterligare genom centrifugering vid 14000 x g i ett 3 kDa centrifugalfilter vid 4 °C.OBS: För att uppnå ett optimalt systemuttryck, utför ribosomtitrering (avsnitt 5.2, tilläggstabell 7). Kontrollera ribosomkompositionen med SDS-PAGE (figur 3A) enligt punkt 1.3.3. Späd ut 2,5 μL av provet med 7,5 μL vatten, blanda med 10 μL 2x Laemmli-buffert och lasta sedan 5 μL och 2,5 μL av proverna till gelén. 4. Energilösning OBS: Kompositionen för den 2,5x energilösning som introduceras här är ett exempel på en lösning som fungerade bra för en vanlig TX-TL-reaktion. För att optimera tidpunkten, förbered energilösningen under dag 2. Beredningen av aminosyralösningen förklaras i detalj, följt av det slutliga förberedelseförfarandet. Aminosyra lösningOBS: Förbered aminosyralösningen i bulk. Att förbereda den mängd aminosyralagerlösningar som krävs för en slutlig volym på minst 2000 μL kommer att minska vägningsfelet för de annars mycket små mängderna. Den totala koncentrationen av aminosyralösningen begränsas av aminosyrornas löslighet och respektive stamlösningskoncentrationer. För standard PURE-systemet, förbered en lösning med en slutlig koncentration på 3,25 mM. Använd beräkningstabellen för aminosyralösning (tilläggstabell 3) som mall. Använd cystein i saltformen för att säkerställa tillräcklig löslighet. Undvik att använda KOH-baserade aminosyrapreparatmetoder. Det är möjligt att direkt väga de exakta mängderna aminosyror i den slutliga aminosyralösningen utan att förbereda stamlösning för alla aminosyror. Detta är dock mer utmanande och mindre exakt. Förbered lagerlösningar för varje aminosyra enligt beskrivningen i tilläggstabell 3,med undantag för tyrosin.OBS: På grund av de olika solubilities av aminosyrorna i vatten, skiljer sig respektive föreslagna koncentrationer av stamlösningen. Minimal massa [mg] ger den ungefärliga minsta massa som krävs för att erhålla en tillräcklig mängd lagerlösning för målvolymen, som referens.OBS: Den minimala massan beräknas med ett överskott på 10%. För en enklare förberedelse av lösningarna, väg inte den exakta mängden aminosyra, utan istället, för massan till hands, justera mängden vatten för att uppnå önskad koncentration. Beräkna mängden avjoniserat vatten (vatten att tillsätta [μL]) som behövs, baserat på den faktiska massa som fylls i (ljusgula celler) och önskad koncentration med hjälp av kalkylbladet i tilläggstabell 3. Solubilisera aminosyrans lagerlösningar genom att virvla tills allt fällning har löst sig. De enskilda aminosyra lagerlösningarna kan lagras vid -20 °C i flera veckor.OBS: Vissa aminosyror är svåra att lösa upp i vatten; processen kan ta lite tid. Väg den exakta mängden tyrosin som krävs för att erhålla en slutlig koncentration på 3,25 mM direkt i röret för aminosyralösningen.OBS: Tyrosin är mycket svårt att lösa upp i vatten. Lägg till det direkt istället för att förbereda en lagerlösning. Tillsätt motsvarande mängder aminosyralagerlösningar och vatten som anges i den slutliga volymen för att tillsätta [μL] kolonn (ljusblå celler) och virvla lösningen väl. Förvara den färdiga aminosyralösningen vid -80 °C tills den används vidare. Beredning av energilösningenOBS: Totalt innehåller 2,5x energilösningen 0,75 mM av varje aminosyra, 29,5 mM magnesiumacetat, 250 mM kaliumgluktamat, 5 mM ATP och GTP vardera, 2,5 mM CTP, UTP respektive TCEP, respektive 8,75 mg/ml tRNA från E. M. 5 mM spermidin och 125 mM HEPES. Förstagångsanvändare förbereder energilösningen i små partier om 200 μL. Förvara de enskilda lösningar som beretts enligt tilläggstabell 4 vid -20 °C eller -80 °C för senare användning. Tina upp alla vattenlösningar som nämns i tilläggstabell 5 på is. Under tiden bereder du lagerlösningarna för de återstående komponenterna som anges i tilläggstabell 4. Håll alla lösningar på is efter beredning.OBS: Tillsätt 500 μL RNase- och DNase-fritt vatten direkt till injektionsflaskan för att lösa upp de frystorkade tRNA. Blanda väl genom skonsam virvel; begränsa pipettering för att undvika att införa RNases. Tillsätt de beräknade volymerna (tilläggstabell 5) av lagerlösningar och vatten och blanda väl med en virvel. Håll lösningen på is hela tiden. Mät lösningens pH genom pipettering 1 μL på en pH-remsa för att säkerställa att lösningens pH-värdet är neutralt. Aliquot energilösningen vid 50-100 μL per rör på is och lagra vid -80 °C tills vidare användning. Under aliquoting, virvla huvudlagret ofta för att förhindra att komponenterna fälls ut.OBS: Gör eventuellt en aktivitetsanalys av den nytillverkade energilösningen mot kommersiella energilösningar, t.ex. lösning A i PURExpress. Om en betydligt lägre prestanda hos systemet med energilösningen observeras kan det vara fördelaktigt att optimera jonkoncentrationerna, särskilt magnesiumjoner, genom titrering (5-20 mM). 5. OnePot REN reaktion DNA-mallOBS: Proteiner kodade nedströms T7-promotorn kan uttryckas i PURE från antingen linjärt eller cirkulärt DNA. Genom att generera en linjär DNA-mall med hjälp av förlängning PCR kan tråkiga kloningssteg utelämnas. De linjära mallarna för denna studie genererades av PCR enligt beskrivningen nedan, med hjälp av ett DNA-polymeras med hög återgivning (Table of Materials). Primersekvenser, smälttemperaturer och termocykelns inställningar som används i denna studie anges i tilläggstabell 6. Utarbetandet av DNA-mallen ingår inte i det dagliga schemat. Ställ in en PCR-reaktion enligt polymerasleverantörens rekommenderas.OBS: Optimerade parametrar för ett DNA-polymeras med hög återgivning(Materialförteckning)anges i tilläggstabell 6. Förstärka målgenen (t.ex. eGFP) som en linjär mall från en plasmid eller genom med hjälp av genspecifika primers (500 nM) (för parametrarna, se kompletterande tabell 6). Förstärkningen genererar korta tillägg för att ge glödgningssekvenser för följande pcr-steg för tillägg. Kontrollera ampliconen på en agarosegel för korrekt storlek och renhet. Använd det förstärkta DNA:t som mall för de efterföljande tilläggsstegen. Ställ in en reaktion på minst 50 μL. Kör 10 PCR-förstärkningscykler med förlängningsprimrar (2,5 nM). Efter att ha slutfört förstärkningscyklerna, tillsätt omedelbart de slutliga primersna (500 nM) till samma reaktion och kör 30 cykler för att förstärka den utökade PCR-produkten. Hitta smälttemperaturer och primersekvenser i tilläggstabell 6. Rena DNA-fragmenten med hjälp av ett DNA-reningskit och elute DNA i nukleasfritt vatten istället för EDTA som innehåller elutionbuffert. Kontrollera den linjära mallen på en agarosegel för korrekt storlek och renhet. Mät DNA-koncentrationen i ng/μL med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer. Ställa in PURE-reaktionenOBS: Den slutliga reaktionskompositionen är 1x energilösning, taggfria ribosomer eller his-tag ribosomer, OnePot PURE-proteiner och DNA-mall. Reaktionsvolymförhållandet omfattar 40% energilösning, 30% protein och ribosomlösning och 30% DNA och vatten. Typiska reaktionsvolymer varierar mellan 5 μL och 25 μL. Kvantifiera uttrycket av ett fluorescerande protein kontinuerligt på en plattläsare. Använd en grön lys in vitro Translation Labeling System, som innehåller fluorescerande märkta Lysinrester i nyligen syntetiserade proteiner, för att verifiera uttrycket av icke-fluorescerande proteiner på en SDS-PAGE-gel. En exempelreaktionsmall ges i Tilläggstabell 7 för att hjälpa till att etablera en REN cellfri uttrycksreaktion. Celler i gult anger värden för användarinmatning, och celler i orange indikerar att ytterligare reagenser eventuellt ska läggas till reaktionen. Håll komponenternas volymförhållanden exakta för att säkerställa rätt jonbalans. Till exempel, för att uppnå en högre proteinkoncentration, öka OnePot-proteinlösningskoncentrationen; Öka dock inte volymen proteinlösning som tillsätts till reaktionen.Fyll i koncentrationen [ng/μL] och längden [baspar] av DNA i motsvarande gula celler i kalkylbladet. Använd 2-10 nM DNA för reaktionen. Fyll i önskad total reaktionsvolym i μL. Ta ut de reagenser som krävs från frysen och tina dem på is.OBS: Återfrysning av komponenterna är möjlig utan att funktionaliteten försämras. Minimera dock antalet frys-tina cykler och tidsproverna lagras på is så mycket som möjligt. Pipettera de beräknade mängderna vatten, DNA och energilösning på ena sidan av PCR-röret eller ett hörn av en brunn på 384-brunnsplattan. Tillsätt den erforderliga mängden ytterligare reagens på samma sida. Minimera antalet prover per experiment för att undvika provavdunstning och experimentell starttidsförskjutning.OBS: Det är viktigt att hålla energikomponenten fysiskt separerad från proteinkomponenterna för att undvika för tidig förbrukning av energikällorna och lägre utbyten. Pipettera de beräknade mängderna protein och ribosomlösning till andra sidan av ett PCR-rör eller det motsatta hörnet av 384-brunnsplattan.OBS: Använd huvudblandningar när det är möjligt för att minska effekten av pipetteringsfel. Efter inledande testning kan ribosom- och proteinlösningarna blandas och lagras som en lösning. Snurra under en kort tid (30 s) för att slå samman reaktionskomponenterna. För att förhindra avdunstning under experiment med plattavläsare, tillsätt 35 μL flytande vax och försegla plattan med ett genomskinligt tätningsmedel (se Materialtabell). Inkubera i minst 3 timmar vid 37 °C. För avläsning på en plattläsare, mät fluorescensintensiteten vid önskad våglängd var 2:e minut (representativa resultat visas i figur 3B). Utför följande steg för Green Lys-märkta exempel. Efter det cellfria uttrycket, inkubera provet med 0,16 μg/μL RNase A i 30 min vid 37 °C för att avlägsna den fluorescerande bakgrunden på Green Lys märkningssats.OBS: Använd RNase A, eftersom andra typer av RNases inte tar bort bakgrunden tillräckligt bra. Visualisera proteinuttrycket genom att köra SDS-PAGE enligt avsnitt 1.3.3. Tvätta den oförstätade gelén försiktigt i avjoniserat vatten och avbilda den på en fluorescerande bildspelare med en excitationsvåglängd på 488 nm. Därefter färga gelén med konventionella Coomassie färgningsmetoder. För lämpliga parametrar se avsnitt 1.3.3.OBS: Utför en titrering av proteinlösningen med rekommenderad ribosomkoncentration och vid behov titrera ribosomer med optimal OnePot-proteinkoncentration efteråt. Använd det kommersiella PURExpress ΔRibosome-kitet som en positiv kontroll. Lösning A, Faktormix och ribosomlösning motsvarar den beredda energin, OnePot-proteinlösningen respektive de renade ribosomerna.