磷酸钙转染法制备假型H5禽流感病毒及抗体中和活性测定
Summary
在这里，我们描述了假病毒包装和抗体中和活性测量的协议。
Abstract
自1996年以来，A/Goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒一直在家禽和野生鸟类中引起流感疫情。有时，人类也会成为它的受害者，从而导致高死亡率。尽管如此，高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍，因为它必须在生物安全3级实验室内处理。为了解决这个问题，在H5 HPAI研究的一些实验中，假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒被证明是研究针对 H5 HPAI 病毒的中和抗体的理想工具。该协议描述了H5 HPAI假病毒制备和假病毒中和测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。
Introduction
自1996年以来，A/goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒在家禽和野生鸟类中持续暴发流感，给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时，人类也会感染它，面临高死亡率1，2。然而，高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍，因为它不能在生物安全3级实验室之外处理。为了解决这个问题，在H5 HPAI研究的一些实验中，假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒足够安全，可以在生物安全2级实验室进行实践。
H5 HPAI 假病毒属于嵌合病毒，由替代病毒核心、带有流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜和报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒 （HIV）、逆转录病毒（如鼠白血病病毒 （MLV） 和水疱性口炎病毒 （VSV）3。具体来说，HIV-1包装系统被广泛用于产生流感假病毒，其中提供的主要基因是 gag 和 pol。HIVgag基因表达核心蛋白。pol基因表达整合酶和逆转录酶，这两者都是报告基因在转导细胞中表达所必需的。模仿替代病毒的基因组，报告基因以RNA形式被拥抱到假病毒核心中。报告基因将在宿主细胞中表达蛋白质。报告基因的基因表达水平可用于测量假病毒感染效率3，4。主要报告基因是萤火虫荧光素酶，用于测量转导细胞中的相对发光单位（RLU）或相对荧光素酶活性（RLA）。其他报告基因如lacZ，Gaussia和Renilla荧光素酶也被使用，只是程度较小5。
假病毒是研究针对H5 HAPI病毒的中和抗体的理想工具。为了测量中和抗体的效力，使用假病毒中和（PN）测定6。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒7，8表面的糖蛋白。HA由用于受体结合的球状头部结构域和用于膜融合的干结构域组成。NA蛋白具有促进病毒释放的唾液酸酶活性7，8。PN 测定可以测量针对 HA 蛋白的中和抗体。针对HA头部和茎区域的中和抗体也可以通过病毒附着和进入测定来检测。与野生型病毒相比，假病毒中和实验具有更灵敏的检测值，可以在2级生物安全实验室中安全处理，并且在实践中通常更容易操作。
该协议详细介绍了H5 HPAI假病毒制备和PN测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒的A/Thailand/1（KAN）-1/2004（TH）毒株为例。为了获得测定中使用的免疫血清，该方案选择源自TH菌株的HA蛋白作为免疫原来免疫小鼠。
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT细胞通常用作包装细胞以产生假病毒。在细胞培养过程中，定期检测支原体至关重要。支原体污染可大大降低假病毒产量，有时接近于零。与其他污染相比，支原体污染不会导致细胞培养基的pH值变化或浑浊。即使是高浓度的支原体，肉眼或显微镜下也看不到。三种常用的支原体检测方法是支原体培养、荧光 DAPI 或 Hoechst 33258 DNA 染色和聚合酶链反应 （PCR）。PCR扩增培养样品中的支原体DNA广?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了江苏省创新能力建设项目（BM2020019）和深圳市科技项目（No.JSGG20200225150702770）、中国科学院战略重点研究计划（XDB29030103）、广东省科技计划（编号：2020B1111340076）和深圳湾实验室开放研究计划（编号：2020B1111340076）。SZBL202002271003）。
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
Referências
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