Bereiding van pseudo-getypeerde H5-aviaire influenzavirussen met calciumfosfaattransfectiemethode en meting van antilichaamneutraliserende activiteit
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor pseudovirusverpakking en het meten van antilichaamneutraliserende activiteit.
Abstract
Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels. Af en toe worden mensen er ook het slachtoffer van, wat resulteert in een hoge sterfte. Niettemin wordt hpai-virusonderzoek vaak belemmerd, aangezien het moet worden behandeld in bioveiligheidsniveau 3-laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen blijken de ideale hulpmiddelen te zijn om neutraliserende antilichamen tegen H5 HPAI-virussen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en pseudovirusneutralisatietests. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen.
Introduction
Sinds 1996 veroorzaken A/gans/Guangdong/1/96-afstamming hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) H5-virussen voortdurende griepuitbraken bij pluimvee en wilde vogels, goed voor enorme sociaaleconomische verliezen in de wereldwijde pluimvee-industrie. Soms raken mensen er ook mee besmet, geconfronteerd met een hoog sterftecijfer 1,2. HPAI-virusonderzoek wordt echter vaak belemmerd, aangezien het niet buiten bioveiligheidsniveau 3-laboratoria kan worden behandeld. Om dit probleem aan te pakken, worden pseudovirussen gebruikt als alternatief voor wild-type virussen in sommige experimenten van H5 HPAI-studies. Pseudovirussen zijn veilig genoeg om te oefenen in bioveiligheidsniveau 2 laboratoria.
H5 HPAI pseudovirussen behoren tot chimere virussen bestaande uit surrogaatviruskernen, lipide-enveloppen met de oppervlakteglycoproteïnen van influenzavirussen en reportergenen. Pseudoviruskernen zijn meestal afgeleid van lentiviraal humaan immunodeficiëntievirus (HIV), retrovirussen zoals muizenleukemievirus (MLV) en vesiculair stomatitisvirus (VSV)3. In het bijzonder wordt het HIV-1-verpakkingssysteem veel gebruikt om influenza-pseudovirus te produceren, waarbij de primaire genen gag pt pol zijn. Het HIV-gaggen brengt kerneiwitten tot expressie. Het pol-gen brengt het integrase en reverse transcriptase tot expressie, die beide nodig zijn voor de expressie van het reporter-gen in getransduceerde cellen. Door het genoom van het surrogaatvirus na te bootsen, wordt het reporter-gen in RNA-vorm omarmd in de pseudoviruskern. Het reporter-gen zal het eiwit tot expressie brengen in gastheercellen. De genexpressieniveaus van reportergenen kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van pseudovirusinfecties te meten 3,4. De primaire reporter is firefly luciferase om de relatieve luminescentie-eenheden (RLU) of relatieve luciferase-activiteit (RLA) in getransduceerde cellen te meten. Andere verslaggevers zoals lacZ, Gaussia en Renilla luciferase worden ook gebruikt, alleen in mindere mate5.
Pseudovirussen zijn ideale hulpmiddelen om neutraliserende antilichamen tegen H5 HAPI-virussen te bestuderen. Om de neutraliserende antilichaampotentie te meten, worden pseudovirusneutralisatie (PN) assays6 gebruikt. Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn glycoproteïnen op het oppervlak van het influenza A-virus 7,8. Het HA bestaat uit een bolvormig hoofddomein voor receptorbinding en een stamdomein voor membraanfusie. Het NA-eiwit heeft de sialidase-activiteit om virusafgifte 7,8 te vergemakkelijken. Een PN-test kan neutraliserende antilichamen meten die gericht zijn op HA-eiwitten. Neutraliserende antilichamen gericht op het hoofd- en stengelgebied van HA kunnen ook worden gedetecteerd door virale hechtings- en ingangstests. In vergelijking met wild-type virussen hebben pseudovirusneutralisatie-experimenten gevoeligere detectiewaarden, kunnen ze veilig worden behandeld in een bioveiligheidslaboratorium van niveau 2 en zijn ze over het algemeen gemakkelijker te bedienen in de praktijk.
Dit protocol presenteert in detail de procedures en kritieke stappen van H5 HPAI pseudoviruspreparaten en PN-assays. Het bespreekt ook de probleemoplossing, beperking en wijzigingen van deze testen. In deze studie werd de A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) stam van H5N1 HPAI virussen als voorbeeld gebruikt. Om de immuunsera te verkrijgen die in assays worden gebruikt, selecteerde dit protocol het HA-eiwit afkomstig van de TH-stam als het immunogeen om muizen te immuniseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT cellen worden meestal gebruikt als verpakkingscellen om pseudovirussen te produceren. Regelmatige mycoplasmadetectie is essentieel tijdens de celkweek. Mycoplasmabesmetting kan de pseudovirusopbrengsten drastisch verminderen en soms bijna nul. In vergelijking met andere verontreinigingen leiden mycoplasmabesmettingen niet tot veranderingen in de pH-waarde of troebelheid van het celkweekmedium. Zelfs een hoge concentratie mycoplasma is niet zichtbaar met het blote oog of onder een microscoop. Drie populaire metho…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de onderzoekssubsidies van het Innovation Capacity Building Project van de provincie Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (nr. 2020B1111340076) en het Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
Referências
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
