Psödotip H5 Kuş Gribi Virüslerinin Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Yöntemi ile Hazırlanması ve Antikor Nötralize Edici Aktivitesinin Ölçülmesi
Summary
Burada psödovirüs paketlemesi ve antikor nötralize edici aktivitenin ölçümü için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda grip salgınlarına neden olmaktadır. Bazen, insanlar da buna kurban gider ve bu da yüksek ölüm oranıyla sonuçlanır. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarında ele alınması gerektiği düşünülerek sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahşi tip virüslere alternatif olarak benimsenmiştir. Psödovirüsler, H5 HPAI virüslerine karşı nötralize edici antikorları incelemek için ideal araçlar olduğunu kanıtlamıştır. Bu protokol, H5 HPAI psödovirüs preparatlarının ve psödovirüs nötralizasyon testlerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını açıklamaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme, sınırlama ve modifikasyonları da ele alınmaktadır.
Introduction
1996 yılından bu yana, A / kaz / Guangdong / 1 / 96 soyundan gelen yüksek derecede patojenik kuş gribi (HPAI) H5 virüsleri, kümes hayvanlarında ve yabani kuşlarda sürekli grip salgınlarına neden olmakta ve küresel kanatlı hayvan endüstrisinde muazzam sosyo-ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bazen, insanlar da onunla enfekte olurlar, yüksek bir ölüm oranıile karşı karşıya kalırlar 1,2. Bununla birlikte, HPAI virüsü araştırması, biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarlarının dışında ele alınamayacağı için sıklıkla engellenmektedir. Bu sorunu ele almak için, H5 HPAI çalışmalarının bazı deneylerinde psödovirüsler vahşi tip virüslere alternatif olarak benimsenmiştir. Psödovirüsler biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarlarında uygulanabilecek kadar güvenlidir.
H5 HPAI psödovirüsleri, vekil virüs çekirdekleri, influenza virüslerinden yüzey glikoproteinleri içeren lipit zarfları ve muhabir genlerinden oluşan kimerik virüslere aittir. Psödovirüs çekirdekleri genellikle lentiviral insan immün yetmezlik virüsü (HIV), murin lösemi virüsü (MLV) gibi retrovirüsler ve veziküler stomatit virüsü (VSV)3 türevlerinden türetilir. Spesifik olarak, HIV-1 paketleme sistemi, sağlanan birincil genlerin tıkaç ve pol olduğu influenza psödovirüs üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. HIV gag geni çekirdek proteinleri eksprese eder. Pol geni, her ikisi de transdübe hücrelerde muhabir genin ekspresyonu için gerekli olan integraz ve ters transkriptazı eksprese eder. Vekil virüsün genomunu taklit eden muhabir gen, RNA formunda psödovirüs çekirdeğine sarılır. Muhabir gen, konakçı hücrelerdeki proteini eksprese edecektir. Muhabir genlerin gen ekspresyon seviyeleri, psödovirüs enfeksiyonu etkinliğini ölçmek için kullanılabilir 3,4. Birincil raporlayıcı, dönüştürülmüş hücrelerdeki bağıl lüminesans birimlerini (RLU) veya göreceli lusiferaz aktivitesini (RLA) ölçmek için ateşböceği lusiferazdır. LacZ, Gaussia ve Renilla lusiferaz gibi diğer muhabirler de kullanılır, sadece daha az ölçüde5.
Psödovirüsler, H5 HAPI virüslerine karşı nötralize edici antikorları incelemek için ideal araçlardır. Nötralize edici antikor gücünü ölçmek için, psödovirüs nötralizasyonu (PN) testleri6 kullanılır. Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), influenza A virüsü 7,8’in yüzeyindeki glikoproteinlerdir. HA, reseptör bağlanması için küresel bir kafa alanı ve membran füzyonu için bir kök alanından oluşur. NA proteini, virüs salınımını kolaylaştırmak için sialidaz aktivitesine sahiptir 7,8. Bir PN testi, HA proteinlerine yönelik nötralize edici antikorları ölçebilir. HA’nın baş ve kök bölgesine yönelik nötralize edici antikorlar viral bağlanma ve giriş testleri ile de tespit edilebilir. Vahşi tip virüslerle karşılaştırıldığında, psödovirüs nötralizasyon deneyleri daha hassas tespit değerlerine sahiptir, Seviye 2 biyogüvenlik laboratuvarında güvenli bir şekilde ele alınabilir ve pratikte genellikle kullanımı daha kolaydır.
Bu protokol, H5 HPAI psödovirüs preparatlarının ve PN tahlillerinin prosedürlerini ve kritik adımlarını ayrıntılı olarak sunmaktadır. Ayrıca, bu testlerin sorun giderme, sınırlama ve modifikasyonları da ele alınmaktadır. Bu çalışmada, H5N1 HPAI virüslerinden A/Tayland/1(KAN)-1/2004(TH) suşu örnek olarak kullanılmıştır. Tahlillerde kullanılan immün serumları elde etmek için, bu protokol TH suşundan kaynaklanan HA proteinini fareleri immünojen olarak seçti.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT hücreler genellikle psödovirüs üretmek için paketleme hücreleri olarak kullanılır. Hücre kültürü sırasında düzenli mikoplazma tespiti esastır. Mikoplazma kontaminasyonu, psödovirüs verimini büyük ölçüde azaltabilir ve bazen sıfıra yakın olabilir. Diğer kontaminasyonlarla karşılaştırıldığında, mikoplazma kontaminasyonları pH değeri değişikliklerine veya hücre kültürü ortamının bulanıklığına yol açmaz. Yüksek konsantrasyonda mikoplazma bile çıplak gözle veya mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Jiangsu eyaleti İnovasyon Kapasite Geliştirme Projesi (BM2020019), Shenzhen Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. JSGG20200225150702770), Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Guangdong Bilimsel ve Teknolojik Projesi (No. 2020B1111340076) ve Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Araştırma Programı (No. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
Referências
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
