Rekonstruere humant retinoblastom in vitro

Summary

Vi beskriver en metode til generering af humant retinoblastom (RB) ved at introducere bialleliske RB1-mutationer i humane embryonale stamceller (hESC). RB-cellelinjer kunne også med succes dyrkes ved hjælp af den isolerede RB i en skål.

Abstract

Human RB er pædiatrisk kræft, som er dødelig, hvis der ikke administreres nogen behandling. Da RB stammer fra kegleforstadier, hvilket er relativt sjældent i gnavermodeller, i mellemtiden med hensyn til forskellene mellem arter mellem mennesker og gnavere, er en sygdomsmodel afledt af mennesker mere gavnlig for at afdække mekanismerne for human RB og søge målene for terapi. Heri beskriver protokollen dannelsen af to genredigerede hESC-linjer med henholdsvis en biallelisk RB1-punktmutation (RB1 Mut/^Mut) og en RB1-knockoutmutation (RB1–^/-). Under processen med retinal udvikling observeres dannelsen af RB. RB-cellelinjerne etableres også ved at adskille fra RB-organoiderne. Alt i alt har vi ved at differentiere de genredigerede hESC-linjer til retinale organoider ved hjælp af en 2D- og 3D-kombineret differentieringsprotokol med succes rekonstrueret den menneskelige RB i en skål og identificeret dens kegle-forløberoprindelse. Det ville give en nyttig sygdomsmodel til observation af retinoblastomets genese, spredning og vækst samt videreudvikling af nye terapeutiske midler.

Introduction

Human retinoblastom (RB) er en sjælden, dødelig tumor afledt af retinale kegleforstadier ^1,2,3, er den mest almindelige type intraokulær malignitet i barndommen⁴. Homozygot inaktivering af RB1-genet er den initierende genetiske læsion i RB⁵. Mus med RB1-mutationer undlader imidlertid at danne nethindetumoren². Selvom musetumorerne kunne genereres med kombinationen af Rb1-mutationer og andre genetiske modifikationer, mangler de stadig funktionerne i human RB⁶. Takket være udviklingen af retinal organoiddifferentiering kunne den hESC-afledte RB opnås og vise tegnene i human RB¹.

Talrige protokoller til retinal organoid differentiering er blevet etableret i det sidste årti, herunder 2D⁷, 3D⁸ og en kombination af 2D og 3D⁹. Metoden, der bruges her til at generere den menneskelige RB, er konsolideringen af tilhængerkultur og flydende kultur⁹. Ved at differentiere RB1-muteret hESC til retinale organoider detekteres dannelsen af RB omkring dag 45, og derefter spredes den hurtigt omkring dag 60. På dag 90 er isolering af RB’er og generering af RB-cellelinjen mulig; desuden omgiver RB næsten alle retinale organoider på dag 120.

hESC-afledt RB er en innovativ model til at udforske oprindelse, tumorigenese og behandlinger for RB. I denne protokol beskrives genereringen af genredigering hESC, differentieringen af RB og karakterisering for RB detaljeret.

Protocol

Denne undersøgelse er godkendt af den institutionelle etiske komité på Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC’er fås fra WiCell Research Institute. 1. Generering af RB1 muteret hESC CRISPR/Cas9 målretningsvektor for knockout (KO) af RB1. Design et par sgRNA. For ablation af RB1 skal du målrette den første exon af dette gen. Den fremadrettede primersekvens er CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, og den omvendte primersekvens er …

Representative Results

Proceduren for RB-generering er belyst i figur 1, som kombinerer den vedhæftede og flydende kultur. Det var muligt at høste den humane RB fra RB1-KO hESC og opnå RB-cellelinjen ved at isolere RB-organoiderne. Her giver protokollen detaljer om differentieringen i forskellige faser (figur 2). Hule kugler dannes i de første 3 dage, som fastgøres til dyrkningsoverfladen og derefter udvides (figur 2</stro…

Discussion

Humant retinoblastom (RB) er forårsaget af inaktivering af RB1 og dysfunktion af Rb-protein. I denne protokol er RB1-KO hESC det afgørende trin for generering af RB i en skål. Selv med RB1-/- hESC er det muligt, at der ikke er nogen ^RB-dannelse på grund af metoderne til retinal organoiddifferentiering¹⁰. I denne protokol er overførslen fra tilhængerkultur til flydende kultur afgørende i differentieringsprocessen. Tætheden af cysterne, typer af pluripot…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML