우리는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)에 이중 대립 유전자 RB1 돌연변이를 도입하여 인간 망막 모세포종 (RB)을 생성하는 방법을 설명합니다. RB 세포주는 또한 접시에서 단리된 RB를 사용하여 성공적으로 배양될 수 있었다.
인간 RB는 소아암으로 치료를 시행하지 않으면 치명적입니다. RB는 설치류 모델에서 비교적 드문 원뿔 전구체에서 유래하기 때문에 인간과 설치류의 종간 차이와 관련하여 인간에서 파생 된 질병 모델은 인간 RB의 메커니즘을 밝히고 치료 대상을 찾는 데 더 유리합니다. 본원에서, 프로토콜은 각각 이대립유전자 RB1 점 돌연변이(RB1 Mut/Mut) 및 RB1 녹아웃 돌연변이(RB1–/-)를 갖는 2개의 유전자 편집된 hESC 계통의 생성을 기술한다. 망막 발달 과정에서 RB의 형성이 관찰됩니다. RB 세포주는 또한 RB 오가노이드로부터 분리함으로써 확립된다. 전체적으로 2D 및 3D 결합 분화 프로토콜을 사용하여 유전자 편집 hESC 라인을 망막 오가노이드로 분화함으로써 우리는 접시에서 인간 RB를 성공적으로 재구성하고 원뿔 전구체 기원을 확인했습니다. 망막 모세포종의 발생, 증식 및 성장을 관찰하고 새로운 치료제를 추가로 개발하는 데 유용한 질병 모델을 제공 할 것입니다.
인간 망막 모세포종 (RB)은 망막 원뿔 전구체 1,2,3에서 유래 한 희귀하고 치명적인 종양이며, 어린 시절에 가장 흔한 유형의 안구 내 악성 종양입니다4. RB1 유전자의 동형접합체 불활성화는 RB5에서 개시되는 유전적 병변이다. 그러나, RB1 돌연변이를 갖는 마우스는 망막 종양2를 형성하지 못한다. 마우스 종양은 Rb1 돌연변이 및 다른 유전자 변형의 조합으로 생성 될 수 있지만, 여전히 인간 RB6의 특징이 부족합니다. 망막 오가노이드 분화의 발달 덕분에, 인간 RB1의 특성을 나타내는 hESC 유래 RB를 얻을 수 있었다.
망막 오가노이드 분화를 위한 수많은 프로토콜이 지난 10년 동안 확립되었으며, 여기에는 2D7, 3D8, 2D 및 3D9의 조합이 포함됩니다. 인간 RB를 생성하기 위해 여기에서 사용되는 방법은 부착 문화와 부유 문화의 통합입니다9. RB1 돌연변이 된 hESC를 망막 오가노이드로 분화시킴으로써 RB의 형성은 약 45 일에 검출 된 다음 약 60 일에 빠르게 증식합니다. 90일째에, RBs의 단리 및 RB 세포주의 생성이 가능하다; 또한, RB는 120일째에 거의 모든 망막 오가노이드를 둘러싸고 있다.
hESC 유래 RB는 RB의 기원, 종양 발생 및 치료법을 탐구하기 위한 혁신적인 모델입니다. 이 프로토콜에서는 유전자 편집 hESC의 생성, RB의 분화 및 RB에 대한 특성화가 상세히 설명된다.
인간 망막 모세포종 (RB)은 RB1 의 불 활성화와 Rb 단백질의 기능 장애로 인해 발생합니다. 이 프로토콜에서 RB1-KO hESC는 접시에서 RB를 생성하는 중추적인 단계입니다. RB1-/- hESC를 사용하더라도 망막 오가노이드 분화 방법으로 인해 RB 형성이 없을 가능성이 있습니다10. 이 프로토콜에서 순응 문화에서 부유 문화로의 이전은 차별화 과정에서 필수적입니다…
The authors have nothing to disclose.
모든 도움을 주신 502 팀에 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받고 있습니다.
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
DPBS | Gibco | C141905005BT | |
EDTA | Thermo | 15575020 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
Nucleofector 4D | Lonza | ||
RPMI | Sigma | R0883-500ML |