Implantasjon av et kranialvindu for gjentatt in vivo-avbildning i våkne mus
Summary
Presentert her er en protokoll for implantasjon av et kronisk kranialvindu for langsgående avbildning av hjerneceller i våkne, hodebeherskede mus.
Abstract
For å forstå den cellulære fysiologien til nevroner og glia i å oppføre seg dyr, er det nødvendig å visualisere morfologien og registrere deres aktivitet in vivo i å oppføre seg mus. Dette papiret beskriver en metode for implantasjon av et kronisk kranialvindu for å tillate langsgående avbildning av hjerneceller i våken, hodebehersket mus. I kombinasjon med genetiske strategier og virale injeksjoner er det mulig å merke bestemte celler og interesseområder med strukturelle eller fysiologiske markører. Denne protokollen demonstrerer hvordan man kombinerer virale injeksjoner for å merke nevroner i nærheten av GCaMP6-uttrykkende astrocytter i cortex for samtidig avbildning av begge cellene gjennom et kranialvindu. Multifotonavbildning av de samme cellene kan utføres i dager, uker eller måneder i våken, oppføre dyr. Denne tilnærmingen gir forskere en metode for å se cellulær dynamikk i sanntid og kan brukes til å svare på en rekke spørsmål innen nevrovitenskap.
Introduction
Evnen til å utføre in vivo multifoton fluorescensmikroskopi i musenes cortex er avgjørende for studiet av cellulær signalering og struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sykdomspatologi 10,11 og cellulær utvikling12,13 . Ved implantasjon av kroniske kranialvinduer er langsgående avbildning mulig, noe som muliggjør gjentatt avbildning av kortikale områder i dager, uker eller måneder13,14 hos levende dyr. Multifotonmikroskopi er ideell for in vivo, gjentatt bildebehandling på grunn av forbedret dybdeprobing og redusert fotodamage forbundet med den infrarøde laseren som brukes. Dette gjør det mulig å studere molekylær og cellulær dynamikk av bestemte celler i ulike kortikale regioner.
Multifotonmikroskopi har blitt brukt til in vivo-avbildning av nevronale og glialceller hos mus 15,16,17,18,19,20. Ulike strategier kan implementeres for å merke bestemte celletyper og interesseområder. En vanlig tilnærming er å drive uttrykket av genetisk kodede fluorescerende proteiner på en cellespesifikk måte ved hjelp av Cre-Lox-rekombinasjonssystemet. Dette kan utføres med genmodifiserte mus, for eksempel ved å krysse tdTomato “floxed” mus (Ai14) med en mus som uttrykker Cre-recombinase under en promotor av interesse21. Alternativt kan celle- og stedsspesifikk merking oppnås med virale injeksjoner. Her injiseres en viruskoding Cre-rekombininase under en cellespesifikk promotor og et virus som koder et floxed gen av interesse, inn i et definert område. Passende celletyper som mottar begge virale vektorer vil da uttrykke de ønskede genene. Disse genene kan være strukturelle markører, for eksempel tdTomato, for å se endringer i cellulær morfologi22 eller genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer), for eksempel GCaMP og/eller RCaMP, for å undersøke kalsiumdynamikk23. Metoder for genetisk rekombinasjon kan brukes individuelt eller i kombinasjon for å merke en eller flere celletyper. En tredje tilnærming, som ikke krever transgene mus eller virale konstruksjoner (som har begrenset emballasjekapasitet), er i utero-elektroporasjon av DNA-konstruksjoner24. Avhengig av tidspunktet for elektroporasjonen, kan forskjellige celletyper målrettesmot 25,26,27.
Når du utfører multifotonavbildning, kan mus avbildes mens de er våkne eller bedøvet. Avbildning av våkne mus kan utføres ved å sikre musen via en vedlagt hodeplate28. Denne tilnærmingen blir mindre stressende ved å tillate relativt fri bevegelse av dyret ved hjelp av metoder, for eksempel frittflytende, luftstøttede Styrofoam-baller29, frittflytende tredemøller1, eller et luftløftet hjemmebursystem der mus er festet med en festet hodeplate og får lov til å bevege seg i et åpent kammer30. For hver av disse bildeforholdene vil det først være nødvendig å habituate musene til bildeoppsettet. Dette dokumentet beskriver habituation og bildebehandling prosedyre ved hjelp av en luftløftet hjem bur system.
Denne protokollen beskriver implantasjonen av et kronisk kranialvindu for langsgående in vivo-avbildning i cortex. Her vil vi bruke mus som betinget uttrykker GCaMP6f i astrocytter for å overvåke kalsiumsignaldynamikk. Videre beskriver dette papiret prosedyren for virale injeksjoner ved hjelp av tdTomato som etikett for nevroner. Dette gjør det mulig å bestemme endringer i nevronal synaptisk struktur og/eller tilgjengeligheten som en strukturell markør som muliggjør gjentatt avbildning av samme astrocytt. Gjennom hele protokollen vil viktige trinn bli fremhevet for å sikre best mulig kvalitet på bilder hentet fra multifotonmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi presentert en protokoll for implantasjon av kroniske kranialvinduer for in vivo-avbildning av kortikale astrocytter og nevroner i våken, hodebehersket mus på et luftløftet hjemmebur. Det er gitt spesifikke eksempler på kranialvindusapplikasjonen for avbildning av astrocytter som uttrykker GECIer og nevronale synaptiske strukturer. Ved bruk av multifotonmikroskopi kan astrocytisk kalsiumsignaldynamikk og strukturell synaptisk dynamikk registreres gjentatte ganger over dager.
<p class="jove_cont…Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
Referências
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
