हम लाइव खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग के साथ ट्रांसलेशनल (प्रोटीन बायोसिंथेसिस) परिसरों को तेजी से स्थिर करने के लिए एक तकनीक पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण क्षणिक मध्यवर्ती और गतिशील आरएनए: प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने में सक्षम बनाता है। क्रॉसलिंक किए गए परिसरों का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में किया जा सकता है जैसे कि गहरे अनुक्रमण-आधारित प्रोफाइलिंग विधियों, माइक्रोस्कोपी और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री में।
मैसेंजर (एम) आरएनए के तेजी से पुनर्वितरण और एमआरएनए अनुवाद के परिवर्तनों से जुड़ी त्वरित प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं के चल रहे होम्योस्टिटिक समायोजन के लिए प्रासंगिक हैं। ये समायोजन यूकेरियोटिक सेल सर्वाइविटी और ‘क्षति नियंत्रण’ के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो पोषक तत्वों और लवणता के स्तर, तापमान और विभिन्न रासायनिक और विकिरण तनावों में उतार-चढ़ाव के दौरान होते हैं। आरएनए स्तर की प्रतिक्रियाओं की अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण, और आरएनए के कई की अस्थिरता: आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती, साइटोप्लाज्मिक आरएनए राज्य का एक सार्थक स्नैपशॉट प्राप्त करना केवल सीमित संख्या में तरीकों के साथ संभव है। ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड, आरएनए-सेक-आधारित राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोग अनुवाद के नियंत्रण के लिए डेटा के सबसे सूचनात्मक स्रोतों में से हैं। हालांकि, एक समान आरएनए और आरएनए की अनुपस्थिति: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण विशेष रूप से तेज गति वाले सेलुलर प्रतिक्रिया मार्गों में विभिन्न पूर्वाग्रहों का कारण बन सकता है। इस लेख में, हम आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण में सहायता करने के लिए, विभिन्न पारमशीलता की यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर लागू तेजी से निर्धारण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम स्थिर आरएनए के अलगाव के उदाहरण प्रदान करते हैं: राइबोसोमल और पॉली (रिबो) सोमल अंशों के साथ उनके सह-तलछट के आधार पर प्रोटीन परिसर। अलग स्थिर सामग्री का उपयोग बाद में राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोगों के हिस्से के रूप में किया जा सकता है, जैसे अनुवाद जटिल प्रोफाइल अनुक्रमण (टीसीपी-एसईक्यू) दृष्टिकोण और इसके डेरिवेटिव में। टीसीपी-सेक्यू-शैली विधियों की बहुमुखी प्रतिभा अब विभिन्न प्रकार के जीवों और कोशिका प्रकारों में अनुप्रयोगों द्वारा प्रदर्शित की गई है। क्रॉसलिंक उत्क्रमण की आसानी के कारण स्थिर परिसरों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अतिरिक्त रूप से आत्मीयता-शुद्ध और चित्रित किया जा सकता है, जो विभिन्न पॉली (रिबो) सोमल अंशों में अलग हो जाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के अधीन होते हैं। इसलिए, स्नैप-चिलिंग और फॉर्मलडिहाइड निर्धारण के आधार पर विधियां, इसके बाद तलछट-आधारित या अन्य प्रकार के आरएनए: प्रोटीन जटिल संवर्धन, तेजी से आरएनए के बेहतर विवरणों की जांच करने में विशेष रुचि हो सकती है: लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन जटिल गतिशीलता।
जीवित जीव अपने जीवनकाल में गतिशील अंतर-और बाहेत्रक परिवर्तनों के अधीन हैं, जिन्हें होमोसेस्टेसिस बनाए रखने और अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए तेजी से प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है। पर्यावरण अनुकूलन की अनुमति देने के लिए, यूकेरियोटिक कोशिकाएं जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के माध्यम से अपने चयापचय को समायोजित करती हैं। जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रतिलेखन और/या अनुवाद के दौरान लगाया जा सकता है; अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं के साथ आम तौर पर अधिक तेजी से होने वाली1,2,3,4. उदाहरण के लिए, अनुवादात्मक परिवर्तन आमतौर पर तनाव की शुरुआत के 1-30 मिनट के भीतर उत्पन्न होते हैं, जबकि ट्रांसक्रिप्शन-स्तर परिवर्तनतनाव जोखिम3,4,5के घंटों बाद पालन करते हैं। साइटोप्लाज्म में मैसेंजर (एम) आरएनए अणुओं की लगातार उपलब्धता के कारण अनुवाद उत्पादन में परिवर्तन अधिक तेजी से प्राप्त होते हैं। इसके विपरीत, प्रतिलेखन स्तर पर, नए एमआरएनए अणुओं का संश्लेषण किया जाना चाहिए, और यूकेरियोट्स में, नाभिक से संसाधित और निर्यात किया जाना चाहिए, जिससेप्रतिक्रिया समय2, 4,6,7,8में व्यापक विलंब होता है।
तनाव के लिए तीव्र अनुवाद प्रतिक्रिया आम तौर पर अनुवाद उत्पादन में एक समग्र कमी की विशेषता है, सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक प्रोटीन के चयनात्मक अप्रेगुलेशन के साथ1,3,4,9. प्रोटीन उत्पादन उत्पादन को कम करने की प्रक्रिया के उच्च ऊर्जा खर्च के कारण महत्वपूर्ण माना जाता है3,7. चयनात्मक अवरोध और अपरेगुलेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए, अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं को जटिल नियामक तंत्रों की एक श्रृंखला द्वारा परोसा जाता है। विनियमन अनुवाद के सभी चरणों में लगाया जा सकता है: दीक्षा, विस्तार, पॉलीपेप्टाइड बायोसिंथेसिस और रिबोसोमल रीसाइक्लिंग की समाप्ति10,11,12,13, लेकिन दीक्षा चरण में सबसे दृढ़ता से प्रदर्शित किया जाता है5,7,9,10,13. दीक्षा के दौरान, यूकेरियोटिक दीक्षा कारकों (ईआईएफ) द्वारा सहायता प्राप्त छोटे रिबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू) को बांधता है, और एक स्टार्ट कॉडन को मान्यता मिलने तक एमआरएनए के 5 ‘ अनट्रालेटेड क्षेत्र (यूटीआर) को स्कैन करता है2,5,6,8,11,12,13. नियामक तंत्र अक्सर अटैचमेंट, स्कैनिंग को प्रभावित करने वाले ईआईएफ को लक्षित करते हैं, और कोडन मान्यता शुरू करते हैं। उदाहरण के लिए, दीक्षा कारक eIF2, एक आवश्यक अनुवाद कारक है कि एक सर्जक मिले-tRNA की भर्ती में एड्सiMet एसएसयू के लिए, अक्सर तनाव की स्थिति में यूकेरियोट्स में लक्षित किया जाता है4,6,11. खमीर में, इस कारक के फॉस्फोरिलेशन पोषक तत्वों के अभाव और ऑस्मोटिक तनाव के तहत प्रेरित किया जा सकता है1,4,11,14,15, और स्तनधारी कोशिकाओं में, अमीनो एसिड भुखमरी, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव, यूवी तनाव, वायरल संक्रमण, और बदल ऑक्सीजन का स्तर इस प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है8,9,11. विशिष्ट एमआरएनए अनुवाद का तेजी से अपरेगुलेशन हाइपोक्सिया के लिए स्तनधारी सेल प्रतिक्रिया में स्पष्ट है, जो एक वैश्विक तेजी से अनुवाद अवरोध और हाइपोक्सिया-अक्षकीय कारकों (एचआईएफ) बायोसिंथेसिस के चयनात्मक अप्रेड्यूलेशन को प्रदर्शित करता है। HIFs प्रतिलेखन कारक हैं, जो तब डीएनए प्रतिलेखन स्तर पर लंबी अवधि के सेलुलर पुनर्प्रोग्रामिंग प्रकाश में लाना8,9,16. इसी तरह की प्रतिक्रियाओं गर्मी तनाव के तहत खमीर में देखा गया है, हीट शॉक प्रोटीन (HSPs) की तेजी से अनुवाद अभिव्यक्ति के साथ देरी प्रतिलेखन स्तर प्रतिक्रियाओं के बाद17,18. पोषक तत्वों के अभाव और गर्मी सदमे के अलावा, खमीर में अनुवाद प्रतिक्रियाओं अलग ऑक्सीजन के तहत अध्ययन किया गया है8,19लवणता5, फॉस्फेट, सल्फर20,21 और नाइट्रोजन22,23 स्तर। इस शोध में खमीर के औद्योगिक उपयोगों के लिए व्यापक निहितार्थ हैं, जैसे कि बेकिंग और किण्वन24,25. ट्रांसलेशनल प्रतिक्रियाएं न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और हृदय रोग जैसे रोगों की समझ को आगे बढ़ाने में भी महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती हैं, जो ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे इंट्रासेलुलर तनावों की विशेषता हैं। कुल मिलाकर, अनुवादात्मक प्रतिक्रियाएं जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण का अभिन्न अंग हैं और यूकेरियोटिक जीवों में तनाव की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए तेजी से अनुकूलन की सुविधा प्रदान करते हैं।
अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, तरीकों की आवश्यकता होती है जो अनुवाद परिदृश्य के न्यूनतम विकृत स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एक शास्त्रीय दृष्टिकोण है जिसका उपयोग एमआरएनए में अनुवाद के अध्ययन में किया जाता है, जिसमें सुक्रोज ग्रेडिएंट्स26, 27के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के माध्यम से एमआरएनए के पॉली (राइबो) सोमल अंशों को शामिल कियाजाताहै। इस दृष्टिकोण का उपयोग व्यक्तिगत एमआरएएनए के लिए अनुवाद के स्तर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन, आरटी-पीसीआर26जैसे डिटेक्शन विधियों के साथ, या विश्व स्तर पर उच्च थ्रूपुट तकनीकों (माइक्रोएरे या आरएनए-एसईक्यू28,29)के साथ मिलकर। एक अधिक विकसित दृष्टिकोण राइबोसोम प्रोफाइलिंग है, जो जीनोम-व्यापी पैमाने पर एक एमआरएनए अणु के साथ राइबोसोम्स को बढ़ाने की स्थिति के अध्ययन के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टोम में अनुवाद की दक्षता का अनुमान और मुख्य और वैकल्पिक स्टार्ट साइटों30, 31के उपयोग की अनुमति देता है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग में उन पर राइबोसोमल उपस्थिति द्वारा संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों का अलगाव और अनुक्रमण शामिल है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग ने हाइपोक्सिक तनाव, हीट शॉक और ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस31, 32सहित कई स्थितियों में अनुवाद गतिशीलता में काफी अंतर्दृष्टि प्रदान की है। तकनीक को खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं सहित कई स्रोत सामग्री प्रकारों के लिए अनुकूलित किया गया है।
जबकि अनुवाद में अनुसंधान की क्षमताओं का विस्तार करने में पॉलीसोम और राइबोसोम प्रोफाइलिंग मौलिक रही है, अनुवाद की प्रक्रिया में विभिन्न अनुवादात्मक मध्यवर्ती और जटिल शामिल हैं जिन्हें इन तरीकों के साथ पकड़ना मुश्किल है11,13। एक अतिरिक्त सीमा तेजी से प्रतिक्रिया प्रकारों का अध्ययन करने की क्षमता की कमी से उपजी है, क्योंकि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स या तो विशिष्ट अनुवाद अवरोधकों (एंटीबायोटिक दवाओं) के अलावा वीवो में स्थिर होते हैं, जिससे कुछ राइबोसोम वितरण कलाकृतियों, या सेल लाइसिस पर पूर्व वीवो विशेष रूप से (एंटीबायोटिक्स) या अनिर्दिष्ट (उच्च नमक या मैग्नीशियम आयन), जिससे कम रहते थे या कम स्थिर मध्यवर्ती मध्यवर्ती33, 34,35.
फॉर्मलडिहाइड का व्यापक रूप से उपयोग न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को क्रॉसलिंक करने के लिए किया जाता है, जैसे क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन (सीआईपी) और क्रॉसलिंकिंग इम्यूनोप्रिपिटेशन (क्लिप) अध्ययन। इसका छोटा आकार और उत्कृष्ट कोशिका पारमशीलता वीवो एक्शन36में तेजी से अनुमति देती है । रैपिड फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग के आधार पर, ट्रांसलेशन कॉम्प्लेक्स प्रोफाइल सीक्वेंसिंग (टीसीपी-एसईक्यू)10,36, 37, 38,39,40के साथ राइबोसोम प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण बढ़ाया गया है। टीसीपी-एसईक्यू, जो पहले खमीर में विकसित किया गया था, स्कैनिंग या पोस्ट-टर्मिनेशन एसएसयू कॉम्प्लेक्स और कई रिबोसोमल कॉन्फ़िगरेशन37,38,41, 42सहित सभी अनुवाद मध्यवर्ती को पकड़ने की अनुमतिदेताहै। इस विधि काउपयोग कईअध्ययनों 10,38, 39,41, 42में किया गया है, जिनमें से कुछ अनुवाद अवरोधकों और फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग दोनों के संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं ताकि अनुवाद की गिरफ्तारी को सुगम बनाया जा सके। तकनीक का एक और संशोधित संस्करण, चयनात्मक टीसीपी-एसईक्यू39,हाल ही में क्रॉसलिंक किए गए परिसरों के इम्यूनोपुरिफिकेशन को शामिल करने, टीसीपी-सेक्यू अनुप्रयोगों के दायरे को व्यापक बनाने के लिए नियोजित किया गया है। फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग की तेजी से, कुशल और प्रतिवर्ती प्रकृति इन दृष्टिकोणों को क्षणिक एमआरएनए का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाती है: अनुवाद जटिल बातचीत, विशेष रूप से अत्यधिक गतिशील अनुवाद-स्तर प्रतिक्रिया मार्गों के संदर्भ में।
यहां हम व्यापक अनुवाद जटिल स्थिरीकरण और अलगाव के उद्देश्य से वीवो फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग की प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। हम खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं(चित्रा 1)के लिए अलग प्रोटोकॉल सूक्ष्म प्रदान करते हैं । हम क्रॉसलिंक-स्थिर सामग्री(चित्रा 1)के बाद के उपयोग के उदाहरणों को रेखांकित करते हैं, जैसे इम्यूनोब्लोटिंग (पश्चिमी-ब्लॉटिंग), इम्यूनो-असिस्टेड शुद्धि (या ‘इम्यूनोप्रिपिटेशन’ का उपयोग करके सह-शुद्ध प्रोटीन कारक का पता लगाने के लिए; आईपी) और ब्याज, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और आरएनए अनुक्रमण के विशिष्ट कारकों वाले अनुवादात्मक परिसरों का संवर्धन।
चित्रा 1:योजनाबद्ध विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप के अवलोकन का चित्रण। ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के वीवो फॉर्मेल्डिहाइड स्टेबिलाइजेशन में मुख्य चरणों को एक फ्लोचार्ट के रूप में चित्रित किया गया है, जो प्रमुख आवश्यक उपकरणों के बारे में जानकारी द्वारा पूरक है। क्रॉसलिंक्ड सामग्री के संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को रेखांकित किया गया है, जिनमें ऐसे उदाहरण शामिल हैं जिन्हें सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है लेकिन सीधे इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया है, जैसे कि आरएनए की स्प्री मनका शुद्धि, आरएनए अनुक्रमण, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
फॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेशन बायोमॉलिक्यूल्स10,36, 46 , 46 ,47,48के वीवो क्रॉसलिंकिंग में तेजी से प्राप्त करने की एक सुविधाजनक और लोकप्रिय विधि है। अन्य संभावित बायोमॉल्यूल लक्ष्यों की तुलना में, ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सफल कैप्चर को कोशिकाओं या अन्य सामग्री की तस्वीर द्रुतशीतन के दौरान तत्काल निर्धारण की आवश्यकता होती है। बिना किसी कमी स्थिरीकरण के बिना, विभिन्न अनुवाद से संबंधित प्रक्रियाओं को जारी रखने की क्षमता है, जटिल वितरण को वीवो राज्य49में बेफिक्र से दूर स्थानांतरित कर रहा है। अनुवादात्मक गिरफ्तारी और रिबोसोमल जटिल स्थिरीकरण के अन्य तरीकों की तुलना में, कोशिका झिल्ली में फॉर्मलडिहाइड कार्रवाई की तेज़ी और क्रॉसलिंक की अंधाधुंध प्रकृति अनुवाद परिसर की अधिकतम विविधता के संरक्षण का वादा करतीहै।
यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण को खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं दोनों में स्थापित और अनुकूलित किया गया है, और अब अन्य समूहों द्वारा अधिक विविध जैविक सामग्री में उपयोग के लिए तरीके प्राप्त किए गए हैं, जैसे कि पूरे कशेरुकी (जैसे, जेब्राफिश भ्रूण)10,38,39,49,51,52 . यद्यपि ये काम सामूहिक रूप से दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा और व्यापक प्रयोज्यता को आश्वस्त करते हैं, लेकिन अनुकूलन और समायोजन की आवश्यकता के कारण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के तेजी से फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग को नए प्रकार की जैविक सामग्री में स्थानांतरित करना कुछ हद तक मुश्किल माना जा सकता है।
विधि की सफलता के लिए एक सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता फॉर्मेल्डिहाइड और सेल संग्रह और व्यवधान तकनीक की एकाग्रता का पुनः अनुकूलन है। कम पारगम्य, छोटे और गोल खमीर कोशिकाओं को बहुत अधिक (कम से कम, 10 गुना) फॉर्मलडिहाइड एकाग्रता और निश्चित कोशिकाओं के शारीरिक व्यवधान की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, संस्कृति में बड़े और चपटे अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं को आसानी से अधिक तय किया जा सकता है और निर्धारण पर कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जबकि निश्चित परिसरों की निकासी को डिटर्जेंट का उपयोग करके झिल्ली व्यवधान के साथ रासायनिक रूप से किया जा सकता है। अंडर-क्रॉसलिंकिंग कम स्थिर या अधिक अल्पकालिक मध्यवर्ती को बाद की स्थिति में अलग या रिसाव करने की अनुमति दे सकता है। ओवर-क्रॉसलिंकिंग राइबोसोमल अंशों को अलग करने और अध्ययन करने की क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है और भारी परिसरों की गहरी कमी जैसे चयनात्मक पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है। हमारे अवलोकन में, यहां तक कि मामूली परिवर्तन, जैसे कि उपयोग की जाने वाली अनुयायी मानव कोशिकाओं के प्रकार, बरामद क्रॉसलिंक्ड परिसरों की उपज को प्रभावित कर सकते हैं और क्रॉसलिंकिंग रेजिमेन के पुनः अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हम यह भी आशा कर सकते हैं कि पौधों की कोशिकाओं जैसे काफी अलग पारमीयता गुणों वाली कोशिकाओं को निर्धारण शर्तों52के अतिरिक्त व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होगी। फिर भी, एक प्रकार की जैविक सामग्री की कल्पना करना मुश्किल है जो दृष्टिकोण के साथ पूरी तरह से असंगत होगा।
स्तनधारी निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक एक विचार घनत्व और इनपुट के रूप में उपयोग की जाने वाली सेल सामग्री की मात्रा है। सेलुलर अनुवाद गतिशीलता पर बाहरी प्रभावों से बचने के लिए कम से कम 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को फिर से बोने या अन्य क्षोभ के बिना लगातार बढ़ने की सिफारिश की जाती है। अधिकांश सेल प्रकारों के लिए लागू है, लेकिन अधिकांश अनुयायी कोशिकाओं के लिए लगातार 70% से अधिक के संगम स्तर प्राप्त करने से प्रमुख संपर्क अवरोध प्रभावों की अनुपस्थिति सुनिश्चित होगी जो अनुवाद दरों को नकारात्मक और अप्रत्याशित रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
एक और दिलचस्प, और संभावित रूप से विशिष्ट सुविधाजनक, इसकी अंधाधुंध प्रतिक्रियाशीलता से उपजी फॉर्मलडिहाइड फिक्सेशन की विशेषता मिश्रित वर्गीकरण की प्रणालियों में ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स पर स्थिरीकरण प्रभाव है। बैक्टीरियल, और माइटोकॉन्ड्रिया, क्लोरोप्लास्ट और विभिन्न इंट्रासेलर परजीवी के और भी अधिक अनुवादात्मक परिसरों, विशिष्ट अनुवाद अवरोधकों के साथ लक्षित करना बेहद मुश्किल रहा है। इसके विपरीत, टीसीपी-एसईक्यू डेटा में, माइटोट्रान्रिप्टोम के पैरों के निशान38,39,50के आंकड़ों में आसानी से नमूदार हैं। एक दिलचस्प बाद में विकास इस तरह के मिट्टी, पानी या आंत के नमूनों में, जहां विश्वसनीय तेजी से अनुवाद गिरफ्तारी और किसी भी अंय साधनों के साथ जटिल स्थिरीकरण के रूप में पूरे microcommunities में अनुवाद की जांच करने के लिए दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है समस्याग्रस्त होगा ।
यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि सबसे जटिल सामग्री (जैसे कठिन और/या भारी ऊतकों) के लिए, कुछ भी कोशिका व्यवधान और सामग्री समरूपता पर तुरंत फॉर्मलडिहाइड स्थिरीकरण के उपयोग को रोकता है । विशिष्ट छोटे अणु अवरोधक33 , 53, 54,55के साथ ट्रांसलेशनल परिसरों को स्थिर करते समय सेल प्रवेश में देरी को दूर करने के लिए यह दृष्टिकोण पहले से ही अक्सर नियोजित कियाजाताहै । यह देखते हुए कि फॉर्मलडिहाइड निर्धारण पारंपरिक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी४५, ५६, ५७,५८जैसे अनुप्रयोगों में पूर्व वीवो/इन विट्रो नमूना स्थिरीकरण के लिए उत्कृष्ट परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है, हम इस मामले में और भी कम नकारात्मक प्रभाव की उम्मीद कर सकते हैं, विशेष रूप से पूरी तरह से तय कोशिकाओं से ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के खराब निष्कर्षण से जुड़े लोग ।
हमारे निष्कर्ष अत्यधिक क्षणिक परिसरों को स्थिर करने के लिए तेजी से फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं, जैसे कि उनमें eIF4A शामिल हैं। यह उल्लेखनीय है कि स्तनधारियों के विपरीत, खमीर eIF4A कैप बाध्यकारी जटिल eIF4F के साथ बहुत अधिक कमजोर रूप से जुड़ा हुआ है और नतीजतन, सामान्य रूप से अनुवादात्मक परिसर। खमीर29,59, 60 , 62 , 62,63में राइबोसोमल सामग्री के किसी भी व्यापक शुद्धिकरणके दौरानआमतौर पर eIF4A खोजाताहै। फिर भी, वीवो-फिक्स्ड यीस्ट सामग्री में,ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सभी अंशों में eIF4A के विश्वसनीय संवर्धन को प्राप्त करना संभव है जहां इसकी उपस्थिति का अनुमान लगाया जाएगा। पहले प्रकाशित सेल-टीसीपी-एसईक्यू डेटा ने eIF2 और eIF3 के संवर्धन का प्रदर्शन किया है जो राइबोसोम्स के साथ अधिक दृढ़ता से संबद्ध है (लेकिन यह भी पता चला कि क्षणिक रूप से होने वाले सह-ट्रांसलेशनल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली)39। इस प्रकार, विधि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के मजबूत और कमजोर संलग्न दोनों घटकों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
संक्षेप में, हमने मुख्य रूप से अनुवाद के दीक्षा चरण में होने वाले परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है और जब एमआरएनए पर न्यूनतम रूप से बेफिक्र रिबोसोमल वितरण की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दृष्टिकोण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के अपेक्षाकृत लैबिल और गतिशील घटकों जैसे eIF4A के स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त है, और इसका उपयोग मोटे तौर पर आवश्यक अनुकूलन के अधीन किया जा सकता है। हमने अनुवाद के तेजी से गतिशील परिवर्तन के परिदृश्यों में फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता के सबूत भी प्रदान किए हैं, जो पर्यावरणीय परिवर्तनों या तनाव की स्थिति के लिए तेजी से पुस्तक सेलुलर प्रतिक्रियाओं जैसे जांच के क्षेत्रों को खोल रहे हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट (DP1801001111 से टी.पी. और एनईएस), नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल इन्वेस्ट्रकेशन ग्रांट (GNT1175388 से N.E.S.) और रिसर्च फैलोशिप (एपी1135928 से टीपी) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी, ऑस्ट्रेलियन नेशनल यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी ऑस्ट्रेलिया की सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, एक ऐसी सुविधा जो विश्वविद्यालय और संघीय सरकार द्वारा वित्तपोषित है ।
Yeast extract | Merck, Sigma-Aldrich | 70161 | |
Peptone | Merck, Sigma-Aldrich | 70178 | |
D-Glucose (Dextrose) | Merck, Sigma-Aldrich | 49139 | |
Adenine sulphate | Amresco | 0607-50G | |
Formaldehyde solution | Merck Sigma-Aldrich | F11635-500ML | ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation) |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific | 10777019 | |
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | COEDTAF-RO Roche by Merck | 11873580001 | |
Magnesium chloride solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | M1028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | E7889 | |
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL | Ambion | AM2294 | |
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) | (Merck/Sigma-Aldrich) | P1944-100ML | |
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | 11033 | |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9740 | |
Glycogen (5 mg/ml) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9510 | |
Ethyl alcohol, Pure | Merck; Sigma Aldrich | E7023 | |
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF | Merck | GE10600023 | PVDF membrane for western blotting |
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | NW04120BOX | Protein gel |
4X Bolt™ LDS Sample Buffer | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | B0007 | LDS sample loading buffer |
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards | BioRad | 1610375 | Protein ladder |
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer | ThermoFischer Scientific | B0002 | PAGE runninjg buffer |
Intercept® (PBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-70001 | Odyssey Blcoking buffer (PBS) |
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632210 | |
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632211 | |
TAP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | CAB1001 | |
Anti-beta Actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Sucrose | (Merck/Sigma-Aldrich) | 84097 | BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC) |
DL-Dithiothreitol solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | 43816 | BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O |
Terumo Syringe 1CC/mL | Terumo Syringe | 878499 | |
Potassium chloride | (Merck/Sigma-Aldrich) | 60128 | |
HEPES | (Merck/Sigma-Aldrich) | H3375 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Tris hydrochloride | Merck/Sigma-Aldrich | 10812846001 | |
Sodium dodecyl sulfate | Merck/Sigma-Aldrich | 436143 | |
IGEPAL CA-630 | Merck/Sigma-Aldrich | I3021 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
Stainless steel grinding jar | Retsch | 02.462.0059 | |
MM400 mixer mill | Retsch | 20.745.0001 | |
Gradient Fractionator | Brandel | BRN-BR-188 | |
Thermomixer R | Eppendorf | Z605271 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices | Eppendorf Safe-Lock | 30121023 | |
Mini Gel Tank | (Thermo Fisher Scientific) | A25977 | PAGE running tank |
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | Beckman-Coulter | 344057 | |
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk | Beckman-Coulter | 331372 | |
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices | Merck | UFC5030 | Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume |
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge | Cambridge Scientific | 15566 | |
Beckman Coulter Optima L-90K | GMI | 8043-30-1191 | |
Nunc EasYFlask 175cm2 | Thermofisher Scientific | 159910 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermofisher Scientific | 14-432-22 | |
25 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1250 | |
10 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1100 | |
DNA lobind tubes | Eppendorf | 30108051 | |
Cold Centrifuge 5810 R | Eppendorf | EP022628188 | for 50 mL tubes |
Orbital Shaking Incubator | Ratek | OM11 | |
Frezco 17 Microcentrifuge | Thermofisher Scientific | 75002402 | |
Eppendorf DNA lo-bind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
Eppendorf® Protein LoBind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108116 | |
SW 41 Ti Swinging bucket rotor | Beckman-Coulter | 331362 | |
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L | Thermofisher Scientific | 51026282 | |
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe | BD Medical | 328822 | |
3 mL syringe with Luer Lok tip | BD Medical | 302113 | |
25 G x 16 mm Hypodermic Needle | Terumo | TUAN2516R1 |